急性腦卒中患者血清PTX3、miR-199a的水平變化及臨床意義

張 芹，張淑青，王新昌，何 楠，魏丹丹，楊科朋

急性腦卒中是一種常見的腦血管疾病，可分為出血性卒中和缺血性卒中，其中缺血性卒中更為常見，約占80%[1]。急性腦卒中具有起病急、病情進展快、致殘率高、致死率高等特點，可對患者的生活質量以及生命健康構成巨大的威脅[2]。由于急性腦卒中治療時間窗較短，因此快速、正確地分型診斷超早期腦卒中具有非常重要的臨床意義，其對患者的治療與轉歸均有直接的影響，除病史和體格檢查、影像學檢查外，實驗室檢查在超早期腦卒中的診斷、分型中也有重要的作用[3]。正五聚蛋白3(pentraxin 3，PTX3)是一種參與了機體炎癥反應的細胞因子，且其在動脈粥樣硬化的形成和發展中均起到了重要的作用[4]。miR-199a是一種與新生血管形成密切相關的微小RNA，過往的研究多為其與惡性腫瘤相關的內容，然而近年來的研究發現[5]，miR-199a在腦血管疾病的發生、發展中也發揮了一定的作用。本研究旨在探討急性腦卒中患者血清PTX3、miR-199a的表達情況，并進一步分析了二者與患者神經功能的關系及其對疾病的輔助診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月到2019年12月期間在我院接受治療的急性腦卒中患者83例作為研究組，納入標準：(1)均為急性缺血性腦卒中，診斷標準參考《中國急性缺血性腦卒中診治指南》[6]；(2)發病至入院時間<6 h；(3)臨床資料完整；(4)患者家屬對本次研究知情同意，并簽署了知情同意書。排除標準：(1)有顱內出血者；(2)合并惡性腫瘤者；(3)腦卒中復發病例；(4)合并慢性炎癥性疾病或者近期有嚴重感染性疾病；(5)存在嚴重心、肝、腎等重要臟器功能障礙者；(6)近期有大型外科手術史者。83例患者中男性53例，女性30例，年齡48～74歲，平均年齡(59.63±5.94)歲，合并基礎疾病：高血壓52例，糖尿病19例，高脂血癥15例，吸煙史35例。質量指數17.52～24.83 kg/m2，平均體質量指數(21.62±2.48)kg/m2。另選取同期在我院進行體檢的志愿者40例作為對照組，其中男性26例，女性14例，年齡43～73歲，平均年齡(58.49±6.24)歲，合并基礎疾病：高血壓18例，糖尿病8例，高脂血癥7例，吸煙史14例。質量指數17.85～25.42kg/m2，平均體質量指數(21.94±2.56)kg/m2。兩組研究對象的一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。本次研究已獲得了我院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 神經功能評估 采用美國國立衛生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale，NIHSS)評估患者的神經功能[7]，該得分越高代表病情越嚴重。根據NIHSS評分對研究組患者進行再次分組，其中≤4分納入到輕度組(26例)，5～15分納入到中度組(30例)，≧16分納入到重度組(27例)。

1.2.2 血清學指標檢測 抽取所有研究對象的靜脈血5 ml，以3000 r/min的轉速離心10min，提取血清，采用雙抗夾心酶聯免疫吸附法檢測血清PTX3、中樞神經特異蛋白(Soluble protein-100β，S100-β)、神經元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase，NSE)的水平。相關試劑盒購于南京建成生物工程研究所，相關檢測均嚴格遵循對應試劑盒的操作指南進行。采用實時熒光定量PCR法檢測血清中miR-199a的相對表達量，Trizol 試劑盒(Fcrmenas 公司)提取血清中的總RNA，逆轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)提取cDNA，以U6為內參基因，引物系列如下，U6正向引物：5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’，反向引物：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’，miR-199a正向引物：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，反向引物：5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’。反應條件：95℃預熱30 s，95℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 15 s，共40個循環。采用2-Ct法計算血清中miR-199a的相對表達量。

2 結 果

2.1 兩組研究對象的相關指標比較 研究組患者的血清PTX3、S100-β、NSE水平高于對照組，血清miR-199a水平低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，如表1所示。

表1 兩組研究對象的相關指標比較

2.2 不同神經功能患者的相關指標比較 三組患者的血清PTX3、miR-199a、S100-β、NSE水平以及NIHSS評分整體比較差異有統計學意義(P<0.05)，重度組患者的血清PTX3、S100-β、NSE水平以及NIHSS評分高于中度組和輕度組，血清miR-199a水平低于中度組和輕度組(P<0.05)，中度組患者的血清PTX3、S100-β、NSE水平以及NIHSS評分高于輕度組，血清miR-199a水平低于輕度組(P<0.05)(見表2)。

表2 不同神經功能患者的相關指標比較

2.3 血清PTX3、miR-199a與神經功能的關系 經Pearson分析顯示，急性腦卒中患者血清PTX3與S100-β、NSE、NIHSS評分均呈正相關(r=0.321、0.358、0.372，P<0.05)，血清miR-199a與S100-β、NSE、NIHSS評分均呈負相關(r=-0.393、-0.412、-0.405，P<0.05)。

2.4 血清PTX3、miR-199a對急性腦卒中的診斷價值分析 ROC分析顯示(見圖1)，血清PTX3、miR-199a對急性腦卒中均有一定的診斷價值，PTX3和miR-199a的曲線下面積分別為0.864(95%CI0.799～0.928)、0.807(95%CI0.704～0.910)，二者聯合診斷時兩者均為陽性結果為陽性，否則為陰性，結果顯示二者聯合可進一步提高對急性腦卒中的診斷價值，具體數據見表3。

表3 血清PTX3、miR-199a對急性腦卒中的診斷價值分析

圖1 血清PTX3、miR-199a對急性腦卒中的診斷價值分析(A：PTX3；B：miR-199a)

3 討 論

腦部血液供應障礙是急性缺血性腦卒中的重要發病原因，腦部組織缺血后會出現缺血、缺氧性損傷，嚴重時可導致部分腦組織壞死，出現相應的神經功能障礙。急性腦卒中是世界第二、中國首位的死亡原因，患者在發病3 m時病死率為9%～9.6%，而致殘率為34.5%～37.1%，嚴重威脅中老年人群的生命健康[8]。據統計[9]，我國近20年來急性腦卒中的死亡率并沒有下降，而且隨著老年化社會的到來，其患病率和發病率已呈增高趨勢，如何有效的防治急性腦卒中已成為我國重要的公共衛生問題。

動脈粥樣硬化是導致斑塊破裂性血栓形成的病理基礎，其為各種缺血性心腦血管疾病的重要病理改變。PTX3是一種與動脈粥樣硬化密切相關的蛋白，位于人第3號染色體q25，其可有效促進機體的炎癥反應，參與了急性腦卒中的發生、發展[10]。近年研究發現，微小RNA在缺血性腦卒中的病理生理機制中扮演著重要的角色，急性腦卒中患者的微小RNA表達譜有明顯變化，且這些異常表達的微小RNA通常與機體的炎癥、免疫反應、內皮功能損傷等有關[11]。miR-199a是近年來發現的與心腦血管疾病密切相關的微小RNA，其可介導機體的炎癥反應，參與了動脈粥樣硬化的形成[12]。本研究結果顯示，研究組患者的血清PTX3水平高于對照組，血清miR-199a水平低于對照組，且隨著神經功能損害加深，患者的血清PTX3水平逐漸升高，而血清miR-199a水平則逐漸降低，由此可見PTX3、miR-199a在急性腦卒中患者血清中呈異常表達，且其表達水平與患者的神經功能損傷情況有關。PTX3是一種炎癥相關因子，其不但可以促進機體的炎癥反應，同時其表達水平也與機體的炎癥反應程度存在正反饋調節的關系，血管平滑肌細胞、內皮細胞在腫瘤壞死因子-ɑ、白介素-6等促炎因子的刺激下會增加PTX3的分泌[13]，進而導致急性腦卒中的血清PTX3水平上升。miR-199a與急性腦卒中的研究尚處于初級階段，其在患者血清中表達降低可能與血流剪切力大小有關，相關研究顯示[14]，血管內皮細胞在受到高剪切力后miR-199a的表達下降，而在受到低剪切力時其表達會明顯上調[15]。血栓的存在會導致血管壁的壓力和壁面剪切力上升，因此在急性腦卒中患者血栓形成的血管壁附近存在較高的血流剪切力，進而會導致血管內皮細胞中的miR-199a的表達下降，這可能是急性腦卒中患者血清miR-199a低表達的原因之一。此外，本研究結果還顯示，急性腦卒中患者血清PTX3與S100-β、NSE、NIHSS評分均呈正相關，血清miR-199a與S100-β、NSE、NIHSS評分均呈負相關，這進一步說明PTX3、miR-199a的表達水平與患者的神經功能有關。PTX3可通過促進平滑肌細胞遷移和增殖、上調組織因子的表達導致機體處于高凝狀態等方面來增加血栓形成的風險，并且在出現急性腦卒中后還可以通過促進炎癥反應加重患者的病情，增加患者的神經功能損傷程度[16，17]。miR-199a亦是一種炎癥相關因子，曾慶壇等[18]的研究顯示，動脈粥樣硬化的斑塊內miR-199a可有效抑制單核細胞炎性反應，還有相關研究顯示[19]，miR-199a下降可導致血管內皮功能障礙，因此miR-199a可能是通過調節炎癥反應和內皮功能來影響患者的病情，進而影響患者的神經功能。在診斷價值方面，ROC分析顯示，血清PTX3、miR-199a診斷急性腦卒中時的曲線下面積分別為0.864(95%CI0.799～0.928)、0.807(95%CI0.704～0.910)，可見二者對疾病均有一定輔助診斷價值。然而兩指標的特異性均較低，故在聯合診斷時采用了串聯實驗，結果顯示，二者聯合可進一步提高對急性腦卒中的診斷價值。

綜上所述，急性腦卒中患者血清PTX3呈高表達，miR-199a呈低表達，且二者的表達均與患者的神經功能密切相關，二者對疾病均有一定輔助診斷價值。由于研究時間所限，僅有少量患者得到了長時間的隨訪，大部分患者的隨訪資料還在統計中，因此并未分析兩指標與患者預后的關系，這一部分研究將在后續完成。