MiR-206和CDK 4在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤中的表達及臨床意義

王曉華 胡金鈺

海陽市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 265100

神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤是大腦和脊髓質(zhì)細胞癌變導(dǎo)致原發(fā)性顱腦惡性腫瘤［1］，具有進展快、高復(fù)發(fā)率、高病死率、預(yù)后差等特點［2］。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的惡性腦瘤之一，約占惡性腦瘤的55%左右［3］。神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生是一個多基因、多環(huán)節(jié)異常改變的綜合進展過程，分子機制錯綜復(fù)雜，致使臨床上治療和預(yù)后改善效果甚微。目前臨床主要采用膠質(zhì)瘤全切術(shù)配合放化療治療神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤，但總體治療效果仍不甚理想［4］。因此，探究其發(fā)病機制，可為臨床更好的治療提供幫助。miRNA與癌癥的發(fā)生和進展過程有關(guān)。有關(guān)研究顯示，miR-206在膠質(zhì)母細胞瘤組織中低表達，通過靶向調(diào)控BCL-2表達影響膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)展［5］。細胞周期依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）參與細胞周期調(diào)控，與乳腺癌細胞增殖、侵襲性生長密切相關(guān)［6］。研究表明CDK4在膠質(zhì)母細胞瘤中高表達，與腫瘤細胞增殖有關(guān)，抑制CDK4表達可靶向治療膠質(zhì)母細胞瘤［7］。但miR-206與CDK4在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中的表達及與預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在探究miR-206與CDK4在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中的表達及與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年8月至2015年10月在本院就診的神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者74例為研究對象，入院時統(tǒng)計患者臨床病理資料。患者中男40例，女34例；年齡范圍15～58歲，＜50歲者39例，≥50歲者35例；腫瘤大小≤3 cm者32例，＞3 cm者42例；WHO分級中Ⅰ～Ⅱ級36例，Ⅲ～Ⅳ級38例；核分裂≤2者29例，＞2者45例。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合《中國腦膠質(zhì)瘤分子診療指南》（2014）診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診為神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者；②患者均為原發(fā)膠質(zhì)瘤且首次行膠質(zhì)瘤全切術(shù)；③經(jīng)溝通后獲得患者及家屬同意獲取組織，并簽署知情同意書。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者膠質(zhì)瘤全切術(shù)后復(fù)發(fā)，再次手術(shù)者；②合并其他惡性腫瘤、全身系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病者；③依從性差無法配合完成治療者；④非正常死亡患者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及與預(yù)處理 患者行膠質(zhì)瘤全切術(shù)中取膠質(zhì)瘤組織及瘤周組織（＞3 cm），以生理鹽水洗凈，一部分放于液氮中速凍5 min后置于-80℃冰箱用于提取總RNA，另一部分備用。

1.2.2 膠質(zhì)瘤組織及瘤周組織中miR-206和CDK4 mRNA表達水平分析 取出凍存標(biāo)本，冰上解凍，按照Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司生產(chǎn)）說明書提取組織總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后確保RNA純度且無降解，取2μg以miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司生產(chǎn)）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系參照SYBR Green PCR master mix試劑（TaKaRa公司生產(chǎn)）說明加配反應(yīng)體系，每個樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)體系：2×Master mix 8μl、cDNA 1μl、20×SYBRI 1μl、PCR forward primer 0.5μl、PCR reverse primer 0.5μl、加無RNase H2O至總體積為20μl。體系加配完成后，放入Bio-Rad熒光定量PCR儀進行反應(yīng)，反應(yīng)程序設(shè)置：97℃預(yù)熱3 min，95℃變性45 s，63℃退火30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)。miR-206以U6為內(nèi)參基因，CDK4以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法計算miR-206和CDK4 mRNA相對表達水平。引物由北京六合華大基因公司合成，引物序列見表1。

1.2.3 組織CDK4蛋白表達檢測 以10%中性緩沖甲醛固定膠質(zhì)瘤組織及瘤周組織，完成固定后行石蠟包埋切片HE染色，中性樹脂進行封片，置于顯微鏡下進行觀察。觀察時隨機取10個高倍鏡視野進行病理切片觀察，并對陽性細胞數(shù)量進行統(tǒng)計。CDK4陽性大多數(shù)位于細胞核中，均以棕黃色顆粒特異性分布于細胞核者視為陽性細胞。由2名主治病理醫(yī)生分別獨立執(zhí)行，采用雙盲法閱片。按照陽性細胞百分比記分：＜5%0分，5%～20%1分，21%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分；按照染色程度：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，褐黃色3分。取兩組積分乘積，≤2分為陰性，＞2分為陽性。

1.2.4 生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-206和CDK4的關(guān)系 關(guān)于miR-206與CDK4之間的關(guān)系主要采用生物信息學(xué)網(wǎng)站（http：//www.microrna.org）進行預(yù)測分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 隨訪 以復(fù)診或電話等方式對神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存情況進行隨訪，記錄患者從手術(shù)治療到腫瘤進展引起死亡的患者例數(shù)計算無進展生存率（progressive-free survival，PFS）。隨訪時間為期36個月，自手術(shù)當(dāng)天始，截止至2018年11月1日。所有患者均完成隨訪，無一例患者失訪。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 以統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0對本研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例（%）表示，比較行χ2檢驗；正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，比較行配對t檢驗；Kaplan-Meier分析神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后3年生存情況。COX回歸模型分析影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險因素；Pearson相關(guān)性分析法分析神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中miR-206和CDK4 mRNA表達水平的相關(guān)性，各組數(shù)據(jù)均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤組織和瘤周組織miR-206和CDK4 mRNA表達分析 神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者膠質(zhì)瘤組織中miR-206表達水平顯著低于瘤周組織（P＞0.05），CDK4 mRNA表達水平顯著高于瘤周組織（P＞0.05），詳見表2。

表2 74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者膠質(zhì)瘤組織和瘤周組織miR-206和CDK4 mRNA表達分析（±s）

表2 74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者膠質(zhì)瘤組織和瘤周組織miR-206和CDK4 mRNA表達分析（±s）

注：miR-206為微小RNA-206，CDK4為細胞周期依賴性激酶4，U6與β-actin均為內(nèi)參基因

組織類型瘤周組織膠質(zhì)瘤組織t值P值miR-206/U6 1.02±0.17 0.68±0.14 12.764＜0.001 CDK4/β-actin 1.01±0.18 1.48±0.27 12.205＜0.001

2.2 神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤CDK4蛋白表達分析 免疫組化結(jié)果顯示CDK4蛋白位于細胞核中，染色呈淺黃色、棕黃色，見圖1。神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織CDK4蛋白陽性表達率顯著高于瘤周組織［66.22%（49/74）比22.97%（17/74）］（χ2＝28.003，P＜0.001）。

2.3 miR-206、CDK4表達水平與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征關(guān)系 根據(jù)膠質(zhì)瘤組織中miR-206表達水平將患者分為miR-206高表達組和miR-206低表達組，根據(jù)免疫組化結(jié)果將患者分為CDK4陽性表達組和CDK4陰性表達組。結(jié)果顯示miR-206、CDK4表達水平與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤長徑、病理分級、腫瘤組織壞死有關(guān)（均P＜0.05），與患者性別、年齡無關(guān)（均P＞0.05），見表3。

2.4 miR-206、CDK4表達水平與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系 對74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者進行為期36個月的隨訪，Kaplan-Meier法分析顯示，miR-206高表達患者的PFS中位時間28.12個月、無進展生存率45.95%，顯著高于miR-206低表達患者的PFS中位時間16.69個月、無進展生存率32.35%；CDK4陽性表達患者的PFS中位時間16.32個月、無進展生存率35.71%，顯著低于CDK4陰性表達患者的PFS中位時間27.38個月、無進展生存率45.72%，詳見圖2。

2.5 影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險因素分析COX單因素分析顯示miR-206表達水平、CDK4表達水平、腫瘤長徑、WHO分級、腫瘤組織壞死是影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險因素，多因素分析結(jié)果顯示miR-206表達水平、CDK4表達水平是影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨立危險因素，詳見表4。

2.6 神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中miR-206、CDK4表達的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示miR-206和CDK4表達水平呈負相關(guān)（r＝-0.642，P＜0.001），詳見圖3A。生物信息學(xué)分析顯示CDK4與miR-206具有靶向關(guān)系，詳見圖3B。

表3 74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者miR-206、CDK4表達水平與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

3 討 論

圖1 細胞周期依賴性激酶4（CDK4）在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者組織中的表達分析（HE染色 ×400）；1A：陰性表達，1B：陽性表達 圖2 74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者微小RNA-206（miR-206）（2A）和細胞周期依賴性激酶4（CDK4）（2B）表達水平與無進展生存率的關(guān)系 圖3 74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者組織中微小RNA-206（miR-206）、細胞周期依賴性激酶4（CDK4）表達結(jié)果；3A：相關(guān)性分析，3B：生物信息學(xué)分析

神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見、最具侵襲性、致命性顱內(nèi)腫瘤［2］。生活方式改變和工作壓力增加，使神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率逐年升高。但神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制尚未完全清楚。研究表明，長期吸煙、酗酒、熬夜、環(huán)境污染、病毒感染、遺傳等多種因素與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生有關(guān)，目前尚未有研究表明某個因素與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者發(fā)病有直接因果關(guān)系［9］。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科技的快速發(fā)展，如手術(shù)切除治療、放射療法、化學(xué)療法及綜合療法等應(yīng)用于神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤治療，但復(fù)雜的發(fā)病原因?qū)е律窠?jīng)腦膠質(zhì)瘤患者治療后總體預(yù)后較差［10］。因此，深入研究神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，對神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者病程監(jiān)測及預(yù)后判斷有重要意義。

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多種基因表達異常有關(guān)，miRNAs是一類特殊的非編碼小分子RNA，通過與靶基因3’UTR區(qū)域發(fā)生特異性結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達，參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及遷移過程［11］。已有研究表明miRNAs在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miR-200c在膠質(zhì)瘤組織中低表達，抑制膠質(zhì)瘤組織的生長和癌細胞的轉(zhuǎn)移［12］，提示miRNA主要通過影響腫瘤組織的生長，參與膠質(zhì)瘤的發(fā)展進程。miR-206是一種保守非編碼RNA小分子，與多種腫瘤發(fā)展進程密切相 關(guān)［13］。有 關(guān) 研 究 表 明，miR-206在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤中表達下調(diào)，其可通過直接靶向抑制卷曲蛋 白7（FZD7）mRNA WNT/β-catenin途徑，從而在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮腫瘤抑制作用，miR-206有可能是治療神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤的潛在靶標(biāo)［14］。此外，Hao等［5］研究發(fā)現(xiàn)miR-206在膠質(zhì)母細胞瘤組織中表達下調(diào)，與腫瘤細胞增殖和侵襲有關(guān)。本研究結(jié)果顯示miR-206在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中的表達水平顯著低于瘤周組織，與Zhou等［14］研究趨勢一致，表明miR-206表達水平 可能與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-206表達水平與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤長徑、病理分級、腫瘤組織壞死有關(guān)，提示miR-206可能參與調(diào)控癌細胞增殖，影響患者腫瘤大小和病理分級。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示miR-206低表達患者術(shù)后3年的無進展生存率顯著低于miR-206高表達患者，提示miR-206可能通過影響腫瘤大小、病理分級、核分裂程度，間接影響患者的預(yù)后。COX分析結(jié)果顯示miR-206表達水平是影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨立危險因素。以上研究結(jié)果提示miR-206低表達可能參與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程，可能通過影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者的發(fā)病進程，影響患者預(yù)后。

表4 COX回歸模型分析影響74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險因素

CDK4是一種細胞周期重要調(diào)控分子，能與細胞周期素D結(jié)合，促進細胞周期的轉(zhuǎn)換，它的活性與結(jié)合周期素依賴性激酶抑制素還是與周期素結(jié)合有關(guān)［15］。研究表明CDK4主要調(diào)控癌細胞G1期向S期轉(zhuǎn)換過程［16］，提示CDK4表達可能與惡性腫瘤的進展有關(guān)。在膠質(zhì)母細胞瘤中CDK4高表達，參與膠質(zhì)母細胞瘤病程進展，抑制CDK4表達可改善患者病情發(fā)展［7］，提示CDK4可能調(diào)控病程發(fā)展，影響患者治療效果。本研究結(jié)果顯示CDK4在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中mRNA表達水平顯著高于瘤周組織，與Xu和Li［7］研究結(jié)果類似，表明CDK4可能參與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)病過程。免疫組化結(jié)果顯示神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中CDK4蛋白陽性表達率顯著高于瘤周組織，表明CDK4在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中的mRNA與蛋白表達水平存在一致性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CDK4蛋白表達與腫瘤大小、病理分級、核分裂有關(guān)，CDK4高表達患者術(shù)后無進展生存率顯著低于低表達者，提示CDK4高表達可能促進腫瘤增殖，導(dǎo)致不良預(yù)后。COX分析顯示CDK4表達水平是神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨立影響因素，提示檢測CDK4表達水平對神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后判斷有一定意義。過往研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs主要通過調(diào)控靶基因表達參與癌癥發(fā)展，Georgantas等［17］研究表明miR-206通過靶向調(diào)控CDK4表達誘導(dǎo)黑色素瘤G1期停滯。凌晨等［15］學(xué)者通過探討miR-206/CDK4信號在卵巢癌生長和化療增敏中的作用顯示，通過采用miR-206 mimics轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞，CDK4表達呈現(xiàn)明顯抑制的情況，而在使用miR-206特異抑制劑后能明顯恢復(fù)CDK4在卵巢癌細胞中的表達，另外熒光素酶報告基因活性分析顯示，miR-206能特異結(jié)合到CDK4 3’UTR，抑制熒光素酶活性，因此其認(rèn)為miR-206通過直接靶基CDK4，從而抑制細胞周期其他因子的表達，降低卵巢癌細胞的生長。還有學(xué)者實驗研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-206前列腺癌細胞中CDK4和細胞周期素G相關(guān)蛋白激酶（GAK）的表達水平顯著降低，因此其認(rèn)為miR-206可干擾兩者的表達［18］。而本研究結(jié)果顯示miR-206與CDK4 mRNA水平呈負相關(guān)，且生物信息學(xué)分析顯示miR-206可靶向結(jié)合CDK4，提示miR-206可能通過靶向結(jié)合CDK4，進而參與神經(jīng)腦細胞瘤發(fā)病進程，影響患者預(yù)后。

綜上所述，miR-206在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中表達下調(diào)，CDK4表達上調(diào)，miR-206可能通過負向調(diào)控CDK4表達參與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)病進程，影響患者預(yù)后。本研究樣本量較少，可能存在一定實驗誤差；此外，miR-206對CDK4調(diào)控機制有待進一步研究。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。