大腸埃希菌主動外排泵的研究進展

閆向龍，石艷春，鄭源強，孫瑤，孫穎，欒艷淼

(內蒙古醫科大學內蒙古自治區分子生物學重點實驗室，呼和浩特 010058)

大腸埃希菌屬腸桿菌科埃希菌屬，為革蘭陰性短桿菌，在自然界中廣泛存在。大腸埃希菌作為人體正常菌群存在于腸道中，可合成維生素K和B族維生素，參與宿主的物質代謝。大腸埃希菌的某些血清型可作為病原體引起腸道內感染，出現腹瀉等癥狀。臨床上分離出的大腸埃希菌可引起腸道外感染，如敗血癥、菌血癥、肺炎、腎盂腎炎、膽囊炎和繼發性腹膜炎。抗生素在治療感染性疾病中發揮重要作用，但隨著抗菌藥物種類的增加以及臨床不合理抗菌藥物的應用，耐藥菌不斷產生。除細菌種屬特性決定的固有耐藥外，細菌產生耐藥的機制還包括產生藥物滅活酶、改變藥物的作用靶點以及形成生物被膜等[1]。通過改變外膜通透性、主動外排等方式可減少藥物的積聚和攝取。對于革蘭陰性桿菌，外膜上存在的主動外排泵是導致其耐藥的主要原因[2]，如大腸埃希菌的AcrAB-TolC(由膜融合蛋白AcrA、外排轉運蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC三部分組成)外排系統[3]、銅綠假單胞菌的MexAB-OprM(由膜融合蛋白MexA、內膜轉運體MexB和外膜通道蛋白OprM組成)外排系統等[4]。這些外排系統的底物主要以各類抗生素為主，也包括一些氧化劑和有機溶劑等。現就大腸埃希菌主動外排泵的研究進展予以綜述。

1 大腸埃希菌主要外排泵家族

對大腸埃希菌主動外排泵的研究發現，主要有5個跨膜轉運蛋白家族參與了抗菌藥物的主動外排[5]，其中，ATP結合盒(ATP binding cassette，ABC)超家族是通過ATP結合和水解推動藥物自由排出的“主要活性”轉運體[6]，而其他4個家族均是以質子泵獲取能量的轉運體，包括易化因子超家族(major facilitator superfamily，MFS)、耐藥節結化細胞分化(resistance nodulation division，RND)超家族、多藥和有毒化合物排出(multidrug and toxic compound extrusion，MATE) 家族以及小多重耐藥性(small multidrug resistance，SMR)家族[7-8]。研究表明，這些外排泵家族的底物具有多樣性，包括抗菌劑[9]、染料、清潔劑和溶劑等[10]。

1.1MFS MFS是最大的轉運蛋白家族，該家族中包含多種轉運蛋白，如金黃色葡萄球菌中的QacA和大腸埃希菌中的MdfA等。MFS轉運蛋白家族依靠質子的溶度梯度作為能量來源實現其功能，其轉運蛋白的方式包括單向轉運、逆向轉運和共同轉運。MFS轉運蛋白的底物也有多種類型，如抗生素、細菌的代謝產物、糖類和離子等。對MFS轉運機制的研究發現，MFS轉運蛋白以一種“交替進入”的機制(即藥物結合位點交替暴露于細胞外部或內部)運行[11]。通常情況下，MFS轉運蛋白家族由一種轉運蛋白構成(如金黃色葡萄球菌中的QacA)，但大腸埃希菌的多重耐藥外排泵則由多種蛋白外排泵和轉運蛋白共同發揮作用[12]。

1.2ABC超家族 ABC超家族利用水解ATP供能實現主動外排功能。人類ABC轉運蛋白P-糖蛋白(P-糖蛋白/ABCB1)[13]、多藥耐藥相關蛋白1(多耐藥相關蛋白1/ABCC1)[14]和乳腺癌耐藥蛋白(乳腺癌耐藥蛋白/ABCG2)[15]在腫瘤多重耐藥中起重要作用。在細菌中，ABC外排泵并不常見，大腸埃希菌中的MacB外排泵首先在革蘭陰性菌中被發現，其主要介導大環內脂類藥物的外排[16]。ABC主動外排泵作用的底物種類較多，除抗生素外還包括氨基酸、糖類、離子和多糖類化合物等，功能性ABC外排泵包括2個負責藥物識別和轉運的跨膜結構域和2個ATP水解的細胞質核苷酸結合域，其主動外排機制是通過上述兩種結構域構象的改變降低藥物與底物結合的親和力，實現其外排功能[17]。

1.3RND超家族 RND泵存在于革蘭陰性菌的內膜中，具有跨膜結構域和周質結構域。RND家族主要成員包括存在于大腸埃希菌中的外排轉運蛋白AcrB和銅綠假單胞菌中的內膜轉運體MexB，AcrB、AcrA和TolC構成AcrAB-TolC三聚體復合物，MexB、MexA和OprM構成MexAB-OprM三聚體復合物[18]。AcrB可介導多種不同底物的轉運，如陰離子、陽離子、兩性離子以及抗生素、化療藥物、毒素、洗滌劑和膽鹽[19]。多藥耐藥轉運體RND家族的結構特點是膜融合蛋白AcrA、外排轉運蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC跨越革蘭陰性菌的雙膜，并直接將有毒物質外排到細胞外環境[20]。但RND多藥泵仍有待進一步深入研究，如轉運體如何與質子泵配合實現其功能以及大腸埃希菌AcrA、AcrB及TolC三者之間動態轉換的實現等均需通過比較晶體結構以及各結構的參數來分析[21]。

1.4MATE家族 MATE家族最早在細菌中被發現[22]，如大腸埃希菌中的洋地黃外排泵和副溶血性弧菌中的諾氟沙星外排泵。洋地黃外排泵的作用底物以抗生素為主，如鏈霉素、卡那霉素和環丙沙星；NorM外排泵的主要作用底物是有毒性的陽離子，如吖啶紅和溴化乙啶。人類MATE轉運蛋白可轉運二甲雙胍和西咪替丁等藥物。有研究在哺乳動物中也發現了MATE家族外排泵，其主要通過尿液將藥物或毒素排出體外，是一種機體解毒方式[23]。研究發現，NorM外排泵的作用底物為非藥物，主要存在于霍亂弧菌和淋病奈瑟球菌中[24]。對MATE晶體結構的研究顯著增強了人們對MATE家族機制的理解，MATE的晶體結構顯示其有一個面向外部的空腔，大約延伸至膜的一半[25]。NorM結構(包含結合的四苯基磷或溴化乙啶)有2個細胞外環，幾乎“覆蓋”了藥物結合位點，表明NorM外排泵的主要作用是結合非藥物(如有毒化合物)的外排[26]。

1.5SMR家族 SMR家族轉運蛋白長度僅100～120個氨基酸，由4個跨膜區螺旋組成，且螺旋內環相對較短，SMR家族轉運蛋白存在于許多不同的細菌中[27]。迄今為止，研究最多的是大腸埃希菌中的反轉運體EmrE和金黃色葡萄球菌中的SMR模孔蛋白[28]。EmrE可以輸送許多不同的親脂陽離子(如乙炔、甲醇)；EmrE的每個單體中均含有一個單膜嵌入谷氨酸殘基(E14)，且EmrE是保守的SMR轉運蛋白同系物，這是質子和底物結合的必要條件[29]。關于EmrE結構和生物化學研究(包括低溫電子顯微鏡、X光晶體學、核磁共振光譜學)表明，EmrE以反向二聚體形式存在[30]。有學者通過點突變對大腸埃希菌反轉運體EmrE的轉運機制進行修改，結果顯示，用質子替代藥物恢復轉運體的起始構象后，谷氨酸殘基與質子進行了交換[31]。EmrE存在3種構象狀態，表明結構的可塑性與靈活性是多藥識別和轉運的基礎[32]。深入研究EmrE結構的可塑性可進一步闡明SMR轉運蛋白的多種功能。

2 AcrAB-TolC外排泵的結構

大腸埃希菌是目前發現外排泵種類最多的細菌，其中以AcrAB-TolC外排泵研究較多。AcrAB-TolC外排泵屬于轉運蛋白RND超家族，RND超家族轉運的底物廣泛。RND超家族包括膜融合蛋白AcrA、外排轉運蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC三個結構，若AcrAB-TolC外排泵系統的結構發生改變，細菌可轉變為敏感狀態，敲除相關耐藥基因后，可增加細菌對藥物的敏感性。

2.1膜融合蛋白AcrA(接合器) 與多數膜融合蛋白結構類似，AcrA由4個線性排列的結構域組成，包括膜近端結構域區、β-桶形結構域、脂酰結構域和α-螺旋發夾結構域[33]。α-螺旋發夾結構域參與了AcrA與TolC周質端的相互作用，而β-桶形結構域和膜近端結構域則與AcrB的對接結構域接觸[34]。一些膜融合蛋白缺乏膜脂蛋白結構域，而其他蛋白質的α-螺旋發夾結構域長度不同或完全缺失[35-36]。膜融合蛋白組成主動外排泵方式的差異導致其功能不同，靈活的蛋白結構是蛋白識別多種底物的基礎。

2.2外排轉運蛋白AcrB(泵) AcrB是RND超家族的代表。AcrB可廣泛識別轉運底物，如抗生素(四環素、氯霉素、β-內酰胺類、新生霉素、梭狀酸、萘啶酸和氟喹諾酮類)、洗滌劑(如十二烷基硫酸鈉、Triton X-100)和類似清潔劑的膽鹽以及陽離子染料、消毒劑，甚至非極性溶劑[37]。AcrB是一種同源三聚體，AcrB組件可分為跨膜結構域、波特域和對接域，其中波特域最靠近內膜，可分為PN1、PN2、PC1和PC2 4種亞結構域，這4種亞結構域可形成近端和遠端結合囊，而近端和遠端結合囊均富含與轉運底物接觸的芳香族、極性和帶電氨基酸殘基[38]。近端和遠端結合囊被一個“開關環”隔開，這個“開關環”可以阻斷底物運輸通道，而近端和遠端結合囊袋可以識別不同類型的底物，近端囊袋有利于AcrB與紅霉素、利福平、β-內酰胺等抗生素的相互作用，而遠端囊袋可與米諾環素或阿奇霉素結合[39-40]。AcrB可轉運底物的種類繁多，但AcrB蛋白識別多種不同化學結構底物的具體過程還需結合其晶體結構以及復雜的空間計算進一步研究[41]。

2.3外膜通道蛋白TolC(通道) 外膜通道蛋白TolC可分解為3個不同的結構域，即β-桶體、α-螺旋桶體和混合α/β-折疊體(又被稱為赤道結構域)[42]。TolC可被招募到許多不同的外排泵中，其中包括MFS外排泵(EmrA、EmrB和TolC)、RND型吖啶外排泵(AcrA、 AcrB和TolC)以及ABC型大環內酯泵(MacA和MacB)[43]。此外，TolC也被稱為Ⅰ型分泌系統，由ABC轉運體激活，并驅動致病細菌的毒性決定因子穿過細胞膜，包括黏附素、毒素或其他對人類和動物細胞定植及感染具有重要作用的蛋白質[44]。但目前ABC轉運蛋白轉運底物并攜帶底物通過TolC通道的機制尚未明確。

2.4調控機制

2.4.1局部調控 局部調控以負性調控因子AcrR為主，AcrR位于AcrAB操縱子的上游，由阻遏基因AcrR編碼，能夠抑制自身基因AcrR和AcrAB的表達[45]。AcrR的N端是典型的螺旋-轉角-螺旋結構，AcrA通過這一結構與DNA鏈結合，附著于AcrAB操縱子的位點，導致該操縱子阻遏[46]。另一方面，AcrAB操縱子受轉錄激活因子MarA的正向調節，MarA的表達發生在MarR阻遏物從MarRAB操縱子的操作位點解離后[47]。AcrR和MarR阻遏物均具有DNA結合和藥物結合位點[48]。研究表明，編碼基因MarR和AcrR的突變可以保持AcrAB-TolC泵的過度激活狀態，而大腸埃希菌AcrR第45位氨基酸突變可導致AcrAB過表達，這種影響的程度主要取決于細菌對四環素和環丙沙星的耐藥水平[49]。

2.4.2全局調控 細菌適應外界環境變化的能力依賴于多個調節網絡，這些網絡以協調的方式控制基因表達，以響應環境刺激。外界刺激信號傳遞給轉錄調節因子，轉錄調節因子與特定開放閱讀框啟動子區的靶DNA相互作用，激活或抑制靶基因的表達[50]。在某種情況下，轉錄調節因子控制不同代謝途徑的基因和操縱子，這些轉錄調節因子又被稱為全局調控因子，以轉錄因子Rob、SoxS和MarA為主，主要構成MarA-SoxS-Rob調控系統，MarA-SoxS-Rob調控系統是細菌適應性反應所必需，在革蘭陰性腸桿菌中高度保守，但在其他革蘭陰性和少數革蘭陽性細菌中未發現其直接同源物以及編碼相似蛋白質的基因[51]。MarA、SoxS和Rob均是RND超家族的成員，對許多刺激存在反應，包括pH值的改變、抗生素的存在和氧化應激等[52]。mobox是全局調控系統的結合位點，可與AcrAB-TolC的啟動子上游結合，從而激活相關基因的表達，MarA、SoxS和Rob的DNA結合結構域在一級序列同源性、DNA序列識別和轉錄激活特性方面均非常相似[53]。然而，MarA、SoxS和Rob的表達或活性由特定信號刺激產生，表明三者相互作用可以產生足夠的反應，雖然每個系統均可獨立發揮作用，但MarA、SoxS和Rob緊密相連，共同構成MarA-SoxS-Rob調控系統[54]。

3 外排泵抑制劑

外排泵是細菌防御的重要機制，可防止抗生素進入細胞內環境，導致抗生素耐藥性產生。因此，目前的研究多集中于發現新型外排泵抑制劑或對已知抗生素進行結構修飾。外排泵抑制劑主要通過阻斷外排泵與抗生素的結合降低其耐藥性[55]。

研究指出，一些抗腫瘤藥物(如利血平、長春新堿)可以降低腫瘤細胞的耐藥性，通過抗癌藥物與P-糖蛋白(屬于ABC家族)結合，抑制外排蛋白的功能[56]。利血平通過抑制NorA外排蛋白阻止其對諾氟沙星的外排作用，從而提高金黃色葡萄球菌對諾氟沙星的敏感性；此外，利血平也能對抗淋病奈瑟菌對四環素、紅霉素和阿米卡星的耐藥性[57]。氰氯苯腙是目前研究最多的質子泵抑制劑，可抑制依賴質子濃度梯度的外排系統，破壞其外排作用，但對于依賴ATP供能的外排泵無抑制作用[58]。

4 小 結

不同外排泵家族是導致細菌耐藥的主要原因，主要包括ABC超家族、RND超家族、MATE家族、SMR家族和MFS等。目前對于AcrAB-TolC外排泵的結構構象、轉運機制以及調控方式等的研究均較清楚，但對于外排泵抑制劑的研究較少，且目前多處于體外實驗階段。隨著細菌體內多種類型外排泵的出現以及不同耐藥機制的共同作用，多重耐藥菌的數量隨之增加。體外試驗表明，外排泵抑制劑與抗生素聯合使用可在一定程度上逆轉攜帶外排泵基因細菌的耐藥性[59]，但外排泵本身的安全性等尚未在體內試驗中得到驗證。因此，對不同外排泵結構及轉運機制進行研究的同時，還應重視外排泵抑制劑在體內的研究。