微RNA在食管癌研究中的新進展

劉燕群，邱世香，劉康，宋桂芹

(1.川北醫學院a.基礎醫學院，b.醫學影像學院，c.第二臨床醫學院，四川 南充 637000；2.南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所，四川 南充 637000)

食管癌是消化道最具侵襲性的腫瘤之一，2018年全球新發食管癌約57.2萬例，因食管癌死亡病例50.8萬，食管癌患病率居所有惡性腫瘤第7位，病死率居第6位，且存在顯著的地區差異，中國的食管癌發病率居第5位[1-2]。食管癌的病理類型分為腺癌和鱗狀細胞癌，其中食管鱗狀細胞癌最常見。目前，食管癌的治療主要以手術切除為主，輔以多學科聯合治療，如放療、化療。隨著基因檢測技術的發展，分子靶向治療成為食管癌的二線治療方案[3]。然而，由于食管癌的早期診斷較困難，確診時多為中晚期，治療效果欠佳，食管癌患者的5年生存率僅為20%～30%[4]，其中腫瘤復發和轉移是影響患者生存的主要因素。因此，了解食管癌發生的分子機制以及尋找新的分子標志物，對于食管癌的預防和治療具有重要意義。

Guo等[5]首次發現，微RNA(microRNA，miRNA)在食管癌組織中存在差異表達譜。隨后多項研究證實，miRNA在食管癌中存在差異表達，并參與食管癌靶基因轉錄后水平的調控，通過負性調控靶基因降解其轉錄產物或抑制其翻譯，進而影響食管癌的增殖、遷移、侵襲及凋亡等生物功能，表明miRNA在食管癌早期臨床診斷、預后判斷以及基因治療方面具有較大的研究價值和發展前景。現對miRNA參與食管癌的形成、進展及其作為潛在生物標志物或治療靶標的應用予以綜述，以闡明miRNA對食管癌的發生發展以及對食管癌患者臨床診治的影響。

1 miRNA概述

miRNA是長度介于17～25個核苷酸長的單鏈非編碼RNA，在細胞核中miRNA編碼基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄產生具有發夾結構的初級轉錄本，初級轉錄本進一步被Drosha和雙鏈RNA結合蛋白DGCR-8加工成約為70個核苷酸的莖環前體分子(前體miRNA)，這些前體分子通過核轉運受體5和核蛋白Ran-GTP轉運到細胞質，再經RNA內切酶Dicer酶切生成成熟miRNA，調控基因表達導致信使RNA(messenger RNA，mRNA)降解或翻譯抑制[6]，見圖1。

Nucleus:細胞核；Cytoplasm：細胞質；Pri-miRNA：初級轉錄本；Pre-miRNA：前體微RNA；RNA pol Ⅱ：RNA聚合酶Ⅱ；Ran-GTP：核蛋白；Exportin-5：核轉運受體5；Dicer：RNA內切酶；miRNA-miRNA duplex：微RNA復合物；RISC：RNA誘導沉默復合體；mRNA Degradation：信使RNA降解；Translational repression：翻譯抑制；miRNA：微RNA

miRNA可以通過堿基配對的方式調控目標mRNA的轉錄后修飾、翻譯等過程。在植物中，成熟miRNA與目標mRNA的3′非翻譯區的全部堿基配對，而哺乳動物中，成熟miRNA僅與目標mRNA的3′非翻譯區的部分堿基配對[7]，導致目標蛋白的表達減少或加速降解。miRNA在惡性腫瘤中的異常表達有多種機制，主要包括擴增、缺失和突變、表觀遺傳沉默，并可根據作用靶點的不同，發揮致癌或抑癌作用。多項研究表明，上調的miRNA一般作為癌基因，通過負性調控作用對一個或多個抑癌基因產生抑制作用，起到促進腫瘤進展的作用；而下調的miRNA一般作為抑癌基因，通過負性調控相應癌基因抑制癌基因的表達，從而減緩腫瘤的發展進程[8-33]。

2 miRNA參與食管癌的發生與發展

2.1食管癌中異常表達的miRNA 近年來，隨著基因測序和分子生物學技術的快速發展，對miRNA在食管癌中作用研究的不斷深入，越來越多的miRNA在食管癌組織和細胞中的表達異常被發現。多項研究發現，在食管癌中miRNA的異常表達主要以下調為主，miRNA通過降解靶基因或抑制其表達等負性調控手段干擾食管癌的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為[6,8-33]。此外，食管癌中也有表達上調的miRNA，且通常對相應靶基因也起負性調控作用，通常作為癌基因，促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制其凋亡。這些表達異常的miRNA對食管癌的作用多樣，通過不同靶點、不同信號通路影響食管癌細胞的增殖、周期、凋亡、侵襲、遷移以及臨床診斷和治療等。食管癌中異常表達的miRNA、分子靶標及其生物學功能，見表1。

表1 食管癌中miRNA的異常表達情況

2.2miRNA的表達影響食管癌細胞的增殖和周期 細胞周期是一個復雜的過程，需要細胞周期蛋白的協調表達，從而導致細胞周期蛋白依賴激酶及其調節因子的順序激活[34]。miRNA參與了食管癌細胞中編碼細胞周期蛋白的mRNA的調控，并可影響細胞周期進展。Ma[12]研究發現，腫瘤組織和細胞中的miR-219-5P表達量明顯低于正常組織和細胞，且腫瘤組織和細胞中的miR-219-5P通過反向調控細胞周期素A2，誘導細胞周期阻滯在G2/M期，抑制細胞增殖。另有研究發現，miR-204-5p、miR-27a、miR-107在食管癌組織和細胞中低表達，分別靶向白細胞介素-11、熱激蛋白90、細胞分裂周期蛋白42，誘導食管癌周期阻滯在G1期，抑制食管癌細胞增殖[16,29,35-36]。miR-130b、miR-21、miR-10b在食管癌組織和細胞中高表達，通過反向調控靶基因的表達起到促癌作用，促進食管癌細胞的增殖[32,37-38]。可見，隨著miRNA研究的深入，更多影響食管癌增殖和周期的miRNA將會被鑒定出，從而為食管癌的靶向治療和早期診斷提供堅實的研究基礎。

2.3miRNA的表達影響食管癌細胞的凋亡 細胞凋亡的發生是一系列基因激活、表達及調控等的作用，常見的介導細胞凋亡的通路有線粒體通路、內質網通路以及死亡受體通路，而參與其中的Bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶蛋白家族是調控細胞凋亡的重要因素，可激活細胞凋亡程序或釋放促凋亡因子，使細胞發生凋亡[39]。在食管癌中異常表達的miRNA，一方面可通過影響Bcl-2家族成員的表達促進或抑制食管癌細胞的凋亡進程，另一方面可通過增強輻射誘導的細胞凋亡。Zheng等[40]發現，miR-145在食管癌組織和細胞中下調，調控靶基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3表達上調，在食管癌細胞中，過表達miR-145或敲低絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3，細胞抗凋亡蛋白Bcl-2水平均降低，促凋亡Bcl-2相關X蛋白水平升高，促進食管癌細胞凋亡，且食管癌中過表達的miR-145使DNA定向聚合酶ζ催化亞基的表達以及蛋白水平明顯降低，進而導致Bcl-2表達水平降低，Bcl-2相關X蛋白和活化的胱天蛋白酶3表達水平升高，誘導食管癌細胞凋亡增加[15]。同樣，在食管癌細胞中，結構蛋白家族成員1表達上調，促進了食管癌細胞的增殖，進而抑制細胞凋亡，過表達的miR-216a-5p抑制了結構蛋白家族成員1的表達，導致抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低，促凋亡蛋白Bcl-2相關死亡啟動子水平升高，促進了食管癌細胞的凋亡[13]。此外，miR-136、miR-27a在食管癌細胞中低表達，靶基因黏蛋白1和熱激蛋白90在食管癌細胞中表達上調，過表達的miRNA可負性調控靶基因，增強食管癌細胞的放射敏感性，促進食管癌細胞凋亡[8,24]。miR-519在食管癌細胞中低表達，而過表達的miR-519使線粒體凋亡通路磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號途徑失活，使磷酸化的蛋白激酶B和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達減少[41]。各種miRNA對食管癌細胞凋亡作用的影響機制各不相同，但目前已知的對食管癌細胞凋亡有影響的miRNA十分有限，還需要更多研究進一步闡明miRNA對食管癌細胞凋亡作用的調控機制。

2.4miRNA的表達影響食管癌細胞的侵襲和遷移 食管癌是一種侵襲能力很強的腫瘤，其侵襲和遷移的能力與食管癌發生轉移的可能性相關。研究發現，食管癌組織中miRNA的特異性表達與食管癌的侵襲遷移密切相關，可在不同程度上調控食管癌細胞的侵襲遷移能力[42]。一方面，原發性腫瘤細胞發生上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，獲得侵襲和轉移的特性，其特征主要為增強細胞間黏附上皮鈣黏素減少，間充質細胞的分子標記波形蛋白和神經鈣黏素增加，導致細胞間黏附減少或丟失，促進腫瘤細胞向周圍組織和器官的侵襲和遠處轉移[43]。Zeng等[16]研究發現，表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)作為多種轉移性腫瘤的治療靶點在食管癌組織和細胞中高表達，miR-133b在食管癌組織和細胞中低表達，過表達的miR-133b可直接靶向抑制EGFR的表達，進而使上皮相關蛋白CK-18和上皮鈣黏素的表達增加、間葉相關蛋白(波形蛋白和神經鈣黏素)的表達減少，抑制食管癌細胞EMT過程和食管癌細胞的侵襲和遷移。有報道稱，蝸牛家族轉錄抑制因子2通過結合其基因啟動子上的E框抑制上皮鈣黏素基因的轉錄和表達，激活腫瘤的EMT過程[43]。在食管癌組織和細胞中，蝸牛家族轉錄抑制因子2表達上調，miR-429低表達，而過表達的miR-429可抑制靶基因蝸牛家族轉錄抑制因子2的表達，引起上皮相關蛋白上皮鈣黏素、β聯蛋白增加，間葉相關蛋白神經鈣黏素、Snail減少，抑制食管癌的EMT過程和遷移[10]。同樣，在食管癌細胞中，過表達的miR-196、miR-4234也可負向調控靶基因的表達，增加上皮相關蛋白表達，減少間葉相關蛋白表達，抑制食管癌的EMT進展和遷移[31,44]。另外，Xie等[45]研究發現，在食管癌細胞中miR-1275通過靶向Wnt家族成員1，使Wnt/β聯蛋白信號通路失活，抑制食管癌細胞的EMT過程和遷移。另一方面，基質金屬蛋白酶家族的蛋白水解酶對細胞外基質的重塑至關重要，其降解是惡性腫瘤侵襲和轉移的先決條件。Zhou等[19]研究發現，miR-34a在食管癌中低表達，而miR-34a過表達可反向抑制靶基因叉頭框蛋白M1的表達，降低基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9的表達水平，抑制食管癌細胞的遷移和侵襲。可見，多種miRNA參與了食管癌細胞的EMT過程和侵襲遷移的調控，對miRNA的研究有助于了解食管癌的發展機制，并為臨床食管癌的復發和轉移的相關研究提供新方向。

3 miRNA在食管癌臨床診療中的潛在價值

3.1miRNA在食管癌輔助診斷中的潛在作用 早期診斷食管癌可有效提高患者的生存率，但食管癌缺乏典型的臨床表現，而目前食管癌診斷的“金標準”——食管鏡下活組織病理檢查具有一定的侵入性，患者確診時大多為中晚期，嚴重影響了患者的臨床治療和生活質量。近年來，隨著miRNA的研究不斷深入，發現部分miRNA可作為診斷食管癌的特異性血清學檢測指標。Li等[18]比較114例食管癌患者和50名健康者的血清miR-29C水平發現，食管癌患者miR-29C的表達水平明顯低于健康人群，與miR-29C低表達者相比，miR-29C高表達者的生存時間更長。此外，與健康人群相比，食管癌患者血清miR-338-5p、miR-27a的表達水平明顯降低，且miR-338-5p的表達水平與較差的生存率以及5-氟尿嘧啶/順鉑新輔助化療的不良反應相關[23-24]。由此可見，miRNA有望成為輔助食管癌診斷的實驗室指標。

3.2miRNA在食管癌輔助治療中的作用 目前，食管癌的主要臨床治療方式仍為手術治療，同時化療和放療也是臨床治療食管癌的重要方式，臨床的化療藥物主要有5-氟尿嘧啶和順鉑等，但耐藥性限制了這些藥物的臨床應用。近年來，隨著對食管癌治療的耐藥機制研究，發現miRNA的異常表達與臨床化療耐藥相關[46]。研究發現，miR-145、miR-29C、miR-338-5p在食管癌組織和細胞中低表達，可分別反向調控相應靶mRNA表達，而過表達miRNA將增強5-氟尿嘧啶對食管癌治療的敏感性，提高患者的總體生存率，抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進凋亡[15,18,23]。Sun等[17]發現，miR-544在食管癌組織和細胞中低表達，E2F轉錄因子5作為其靶點在食管癌組織和細胞中高表達。miR-544可反向調控靶基因E2F轉錄因子5，抑制其表達，增強食管癌細胞對順鉑的敏感性，抑制食管癌細胞的增殖，有望成為食管癌治療的潛在靶點。同樣，Zheng等[40]研究發現，miR-145通過直接抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路，誘導食管癌細胞凋亡，從而增強順鉑對食管癌治療的敏感性。

放療也是臨床常用治療方式之一，但腫瘤常存在內在抗輻射性，miRNA可參與調控靶基因，以增強其抗腫瘤輻射的敏感性。Wang等[24]發現，miR-27a在食管癌組織中低表達，過表達miR-27a將抑制熱激蛋白90表達，抑制食管癌細胞增殖，輻射誘導細胞凋亡增加，增強輻射治療食管癌細胞的敏感性。同樣，Zhang等[41]研究發現，miR-519在食管癌細胞中低表達，并與患者總體預后生存不良相關，過表達miR-519導致磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路失活，增強食管癌細胞對放療的敏感性。可見，多種miRNA可增強抗腫瘤藥物的敏感性以及放療的敏感性，有望輔助腫瘤的臨床治療，提高患者的生存和生活質量。

3.3miRNA在食管癌預后判斷中的作用 在食管癌的治療過程中，預測食管癌患者的生存時間、疾病進展速度以及治療效果對判斷患者預后十分重要。miRNA在組織和循環系統中的表達水平穩定可靠，有望成為食管癌患者的有效預后因子。miR-33a-5p、miR-124-3p作為抑癌基因，在食管癌組織和細胞中低表達，其低表達與患者總體預后不良相關，并且與晚期TNM分期以及淋巴結轉移相關[9,22]。Zabihula等[20]研究顯示，miR-490-3p的表達值與食管癌患者的腫瘤分期和腫瘤大小相關，Ⅲ期和Ⅳ期患者的miR-490-3p表達值明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期患者，腫瘤直徑>3 cm患者的miR-490-3p表達量明顯低于腫瘤直徑<3 cm患者。miR-21亦為致癌基因，Li等[37]發現，食管癌組織中miR-21的表達明顯增加，其表達與臨床晚期呈正相關。另有多項研究顯示，miR-30c、miR-516、miR-375、miR-519等也與患者預后總體生存率相關[27,29,36,41]。因此，miRNA有助于確定食管癌患者預后，有望成為判斷食管癌患者預后的生物標志物。

4 展 望

在食管癌的眾多研究中，對miRNA表達模式改變的研究可為食管癌的發病機制提供實質性幫助，通過研究miRNA下游相關靶點，可進一步明確參與食管癌發生發展的機制。功能實驗表明，miRNA與癌基因或抑癌基因mRNA相互作用，控制癌細胞周期、凋亡以及癌細胞的侵襲和遷移能力。食管癌中miRNA的異常表達可通過調控細胞周期蛋白、凋亡相關蛋白Bcl-2、Bcl-2相關X蛋白等影響食管癌細胞的增殖和凋亡，同時miRNA也可調控細胞鈣黏蛋白表達影響細胞侵襲和遷移，許多miRNA可參與增強食管癌細胞對臨床放療和化療藥物的敏感性，降低耐藥性，有望成為輔助臨床診斷食管癌的潛在生物標志物和治療分子靶標，具有重要的臨床價值和應用前景。

miRNA作為一種新的基因治療方式，具有較好的治療前景，但仍存在一些臨床問題有待進一步研究證明，如單個miRNA調控多個靶基因，一個靶基因被多個miRNA共同調控。因此，其臨床治療的特異性仍需進一步研究，如開發收集分析患者樣品的合理方案用于食管癌的臨床診斷；合理過表達或敲低相關miRNA以增強食管癌患者對放療和化療藥物的敏感性等用于食管癌的臨床治療。因此，食管癌中miRNA作用的分子機制及臨床應用仍需進一步研究，以為臨床診斷和治療提供新思路。