乙型肝炎表面抗原酶聯免疫吸附試驗試劑在血液篩查中的臨界值設置

李英蓮, 陳富強, 王 靜, 劉 虹, 顏 鑫, 陳劍鋒

(山東省血液中心 檢驗科, 山東 濟南, 250014)

隨著酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑質量的不斷改進和采供血系統核酸檢測全覆蓋的實現，為適應血站技術的發展需求，國家衛生健康委對《血站技術操作規程(2015 版)》進行修改完善，制定了《血站技術操作規程(2019 版)》(以下簡稱《規程》)。《規程》對血液檢測項目和方法中的檢測策略進行了調整，規定人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染標志物應至少采用核酸和血清學試劑檢測各1次。目前，血站實驗室一般根據試劑說明書來設定試驗參數，以被測物的吸光度值/臨界值(S/CO值)判定結果，若說明書未建議設置灰區，則將S/CO值≥1判為反應性, S/CO值<1判為陰性。為降低弱陽性樣本漏檢率，有些實驗室主動將結果反應性判定值下調，設置不同的灰區，但國家衛生管理部門對試劑的灰區設置并無統一規定，各血站對同一廠家試劑可能設定不一，有些實驗室則不設置。由于《規程》確定了對HIV、HBV、HCV這3種病原體實施1遍ELISA檢測策略的合法性，本研究對2017年本中心參加的國家衛計委臨床檢驗中心牽頭組織的“血液篩查試劑多中心評估項目”所得部分數據進行分析，探討2種乙型肝炎表面抗原(HBsAg)ELISA 試劑設置灰區的必要性及設定范圍，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究資料

樣本總數為3 383份，其中HBsAg陽性樣本387份(原國家衛計委臨床檢驗中心提供)，陰性樣本2 996份(濟南地區日常無償獻血者樣本)。

1.2 儀器與試劑

STAR自動化樣本處理系統(Microlab STAR，瑞士Hamilton公司)，全自動酶聯免疫分析系統(Microlab FAME2420/2430，瑞士Hamilton公司); 上海一家生物有限公司生產的HBsAg診斷試劑盒(ELISA法，以下稱“國產試劑”)，意大利Diasorin公司生產的HBsAg診斷試劑盒Murex HBsAg Version 3(ELISA法，以下稱“進口試劑”); 中和試驗試劑為羅氏試劑(美國)和雅培試劑(美國)，化學發光試劑為羅氏(美國)化學發光試劑和安圖(中國)生物化學發光試劑。

1.3 檢測方法

按照實驗室常規操作和衛生部臨床檢驗中心對血清盤的檢測要求，使用4種試劑對樣本進行平行檢測，灰區下限分別設置為臨界值(CO值)的0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0倍(即S/CO值分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0)，根據不同反應性判定值對檢測結果進行判定。

1.4 樣本最終結果的確定

4種試劑檢測結果均呈反應性(S/CO值≥1.0)的樣本，判為陽性，反之則判為陰性; 當4種試劑出現檢測結果不一致時，挑出樣本進行雙孔復檢，若有任何1種試劑1孔或2孔呈反應性(S/CO值≥1.0)則判為可疑，送衛生部臨床檢驗中心進行確認，以反饋結果為準。臨床檢驗中心使用雅培/羅氏公司的化學發光法試劑、雅培/羅氏公司的化學發光法中和試驗試劑、索林公司的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑和核酸檢測(NAT)技術進行補充實驗和/或確認實驗。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0統計學軟件分析數據，數據比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。計算不同S/CO值下試劑的約登指數，約登指數=(靈敏度+特異度)-1, 以S/CO值為橫坐標、約登指數為縱坐標繪制曲線。

2 結 果

2.1 HBsAg陽性樣本檢測情況

423份HBsAg陽性樣本中, S/CO值為1.0時，國產試劑出現46份假陰性，進口試劑出現28份假陰性，同時使用2種試劑時出現假陰性25份。S/CO值≥0.3時，進口試劑的靈敏度均高于國產試劑，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 423份HBsAg陽性樣本檢測結果

2.2 日常陰性樣本檢測情況

平行檢測日常樣本2 997份，其中1份樣本4種試劑檢測均呈反應性(S/CO值≥1.0), 不納入本次分析范圍。21份單試劑反應性樣本送衛生部臨床檢驗中心檢測，反饋結果均為陰性，故陰性樣本合計2 996份。S/CO值為0.2～1.0時, 2種試劑的特異度差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2 996份日常陰性樣本檢測結果

2.3 約登指數

國產試劑在最大約登指數(0.957)時的S/CO值為0.4, 進口試劑在最大約登指數(0.971)時的S/CO值為0.7, 見表3。

表3 2種試劑在不同S/CO值下的靈敏度、特異度及約登指數比較

3 討 論

《規程》中制訂的有關獻血者血液的檢測策略，是各血站必須遵守的行業標準，是預防經輸血傳播相關傳染病和確保臨床用血安全的重要技術規范?！兑幊獭窓z測策略中規定, HIV、HBV和HCV感染標志物應至少采用核酸和血清學試劑各進行1次檢測。根據該檢測策略，血站可對HIV、HBV和HCV這3種病原體實施1遍ELISA檢測，目前各血站對于采取何種措施來確保檢測結果的準確性持有不同意見，但選擇一種靈敏度高的試劑以及設置合適的灰區防止弱陽性樣本的漏檢是大多數血站的考慮重點。京津冀15家血站的獻血者及血液檢測策略中, 14家血站實驗室在ELISA檢測時設定了灰區，范圍為0.5～0.9, 其中乙肝第1種試劑使用實驗室12家，設置灰區0.5～0.7的有7家，占試劑使用實驗室總數的58.3%(7/12)[1]。ELISA灰區是實驗室為檢出弱陽性樣本而自行設定的，能夠降低試劑因分析靈敏度較低帶來的漏檢風險，但灰區的設定也會不可避免地增加一些假陽性結果，浪費掉原本合格的血液樣本。

約登指數代表一種試劑檢測真陽性與真陰性的總能力，其兼顧靈敏度和特異度，是分析血液篩查試劑檢測性能的一種常用指標，指數越大表示真實度越高。雖然血液篩查試劑最重要的指標是靈敏度，但應用時也要考慮特異度，為了避免增加更多的假陽性，臨床可以對檢測出來的反應性樣本補充確證試驗，若為陰性則放行。

國家衛健委臨床檢驗中心對2018年第一季度全國26個省(市、自治區)61家血站實驗室質量指標進行分析，使用本次評價的國產試劑的血站有18家，其中1家設置灰區下限為0.5倍CO值, 4家設為0.7倍CO值, 5家設為0.8倍CO值, 3家設為0.9倍CO值，另外5家未設置灰區。本研究檢測了423份HBsAg陽性樣本，國產試劑在約登指數(0.957)最大(灰區下限為0.4倍CO值)時有11份陽性漏檢，進口試劑在約登指數(0.971)最大(灰區下限為0.7倍CO值)時有4份漏檢，由此可見，若實施1遍HBV ELISA檢測，實驗室應對選用試劑的灰區范圍進行評估。目前血站操作規程和相關文件并未規定試劑的灰區設置標準，大多數實驗室按照試劑使用說明書設定或自行設定，如國內有13家血站實驗室使用了本次評估的國產試劑，其中1家設定S/CO值為0.7, 1家設為0.8, 6家設為0.9, 另外5家未設置灰區。

洛陽市中心血站在106份灰區(S/CO值為0.6～<1.0)樣本中檢出12 份陽性，說明ELISA法檢測出的“灰區”標本中存在一定數量的陽性標本[2]。張秀慧等[3]對蚌埠市中心血站采集的136份灰區(S/CO值為0.7～<1.0)樣本進行確認，發現10份呈陽性，表明了灰區設置的必要性。王慶敏等[4]對國內常用的7種HBsAg ELISA檢測試劑盒灰區臨界值進行研究，同樣認為有必要設置灰區，但要結合本實驗室的檢測能力先進行實驗室驗證，然后確定反應性判定值范圍，并認為反應性判定值設定為S/CO值≥0.3(國產試劑)、S/CO值≥0.6(進口試劑)為宜。陳洪生等[5]分析了2011—2013年解放軍寧波血站發現的25份灰區(S/CO值為0.3～1.0)樣本確證結果，發現S/CO值為0.3～0.5的標本，驗證試驗沒有陽性，達到0.7時出現1份陽性。但北京市紅十字血液中心檢驗科的一項研究[6]卻認為，灰區不可能解決“窗口期”問題，引入更高級的檢測技術才是關鍵，其試驗結果支持取消灰區設置。另外一項研究[7]也表明，血清免疫逃逸變異 HBsAg是導致HBsAg ELISA灰區的重要原因，提升變異 HBsAg檢測能力有助于臨床診斷。

NAT技術能夠有效縮短病毒檢測的“窗口期”，進一步提升用血安全性。中國于2010年開始對血液篩查的NAT技術進行評估，《血站技術操作規程(2015年版)》將NAT納入血液檢測方法中，實現全國血站NAT全覆蓋, ELISA檢測與NAT技術各具優勢，互為補充，兩者聯檢可有效降低輸血感染風險，且對HBV DNA的檢出率極高[8-13], 避免了許多窗口期和隱匿性HBV感染者的血液制品流向臨床。

NAT與HBsAg血清學ELISA檢測陽性結果也存在不一致情況，深圳市血液中心對236 例乙肝中和試驗確證陽性樣本進行核酸檢測, NAT檢出率為71.2%(168/236)[14], 而廣州地區HBsAg(+)/NAT(-)獻血者在無償獻血者中的比率為0.19%, 在HBsAg雙試劑確認陽性獻血者中的比率為24.87%[15]。此外，陳顯等[16]在28 份HBsAg灰區樣本中檢出7份陽性，且S/CO值為0.5～<0.6區域3份，對其中4名獻血者于獻血3個月后追蹤隨訪, 3名確證試驗陽性但NAT陰性，說明NAT技術在提升HBsAg灰區樣本的檢出率方面并無優勢，另外各NAT系統的檢出率也不相同[17], 故血站也應重視血液篩查試劑的選擇和質量控制。本次評估的國產試劑的說明書中未設置灰區，進口試劑則規定S/CO值為0.90, 按照說明書規定值0.90進行判定, 423例陽性樣本國產試劑漏檢44例，進口試劑漏檢18例，所以若實施1遍ELISA檢測，進口試劑為首選，但需要對灰區樣本進一步確認，以甄別其中的假陽性，為獻血者回告和歸隊提供依據。