胃饑餓素治療小鼠支氣管哮喘的作用機制及對細胞焦亡的影響

努爾阿米娜·鐵力瓦爾迪, 李 新, 韓利梅, 尼格拉·伊力哈木, 齊曼古力·吾守爾

(新疆醫科大學第二附屬醫院 呼吸內科, 新疆 烏魯木齊, 830063)

支氣管哮喘是一種常見的呼吸系統慢性疾病，其特征常見于收縮刺激引起的氣道炎癥、重塑和反應過度[1-2]。細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，是一種程序性細胞死亡，表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內容物釋放而激活強烈的炎癥反應[3-4]。胃饑餓素是28個氨基酸組成的多肽[5], 可以促進食欲，并參與短期攝食控制和長期能量代謝控制[6]。研究[7]顯示胃饑餓素可調節促炎細胞因子的分泌，并具有抗炎作用，哮喘加重患者的胃饑餓素水平明顯降低。目前研究顯示胃饑餓素能夠緩解哮喘的內質網應激起到治療作用。但胃饑餓素對哮喘的療效及細胞焦亡在其中發揮的作用尚不明確。本研究通過構建小鼠哮喘模型，研究胃饑餓素對哮喘的治療作用及對細胞焦亡的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與構建模型

從遼寧長生生物獲得8～10周齡的SPF級(無特定病原菌級)雄性C57BL/6小鼠30只，整個實驗過程均處于標準條件下(22～24 ℃和60%濕度, 12 h光照/12 h黑暗)，將其置于層流柜中，并使用標準食物(SPF級飼料)。所有動物程序獲得了新疆醫科大學第二附屬醫院動物保護委員會的批準。

將小鼠隨機分為對照組、模型組[卵清蛋白(OVA)造模]和治療組(OVA聯合胃饑餓素)，每組10只。通過OVA(Sigma-Aldrich，USA)誘導哮喘小鼠模型，造模方法為分別在第0、14天腹腔注射含OVA(10 μg)和氫氧化鋁(20 mg)的0.2 mL致敏劑進行處理，對照組用生理鹽水代替。激發過程用1%體積濃度OVA制成的霧化劑，于第28～30天置于5 L密閉容器中，使小鼠暴露在OVA氣霧中，每天30 min, 對照組采用生理鹽水進行代理。治療組通過嵌入小鼠皮下組織的ALZET微型滲透泵(型號2004, Durect Co, USA)在OVA第1次造模前1 d注射胃饑餓素(每天1×10-9mol/kg)(Phoenix Pharmaceuticals, USA)[6]。對照組和OVA組均裝有帶載液的泵。

1.2 氣道反應性測定

腹腔注射動物用戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)。通過頸椎中切口暴露氣管并切開，然后插入18號針頭。將由計算機控制的小型動物呼吸機連接至小鼠。用10 mL/kg的潮氣量(呼吸頻率為150次/min)和呼氣末正壓(2 cmH2O)準正弦通氣，產生與自發呼吸相似的平均肺容量(包括將呼吸機的呼氣口連接到水柱上)。通過呼吸機，內聯霧化器直接產生濃度為50 μg/mL～50.0 mg/mL生理鹽水的甲基膽堿氣霧劑，以評估氣道反應的差異。計算呼吸阻力 (RRS) 值，連續收集每次給藥后的甲基膽堿。最大RRS值描述為鹽水噴霧后基線的變化百分比。

1.3 肺部組織形態學染色

小鼠處死后，結扎左肺并摘除，左肺用4%甲醛固定，石蠟包埋后進行蘇木精-伊紅染色法(HE)染色，采用Masson染色檢測纖維化，最后于尼康TS2型倒置顯微鏡下觀察肺部組織形態，放大倍數為200倍。

1.4 肺組織巨噬細胞檢測

采用免疫組織化學方法進行巨噬細胞染色，將切片與CD68抗體(Abcam，USA)于4 ℃冰箱中孵育并保存過夜，將載玻片從冰箱中取出，放入磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗3次，每次5 min, 擦干組織周圍的PBS后加入二抗，然后置于37 ℃溫箱中0.5 h, 將載玻片從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5 min, 擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑(顯色劑的配置: 在1 mL水中加1滴二氨基聯苯胺(DAB)，搖勻，然后加1滴H2O2, 搖勻，再加1滴磷酸緩沖液，搖勻后，于尼康TS2型倒置顯微鏡下觀察肺部組織形態情況，放大倍數為200倍。

1.5 支氣管肺灌洗液(BALF)細胞分類計數

將1 mL注射器插入右主支氣管，取1 mL PBS灌洗右肺，反復3次，回收率為80%以上。回收灌洗液后離心10 min, 收集上清液儲存于-20 ℃冰箱。細胞沉淀制作涂片，以4%甲醛固定后行HE染色，于倒置顯微鏡下(放大倍數為200倍)計數400個細胞，分別計數嗜酸性粒細胞和中性粒細胞。

1.6 肺泡灌洗液炎癥因子檢測

使用酶聯免疫吸附法(ELISA)(Bioscience，USA)測定BALF中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)水平。白細胞介素-5(IL-5)和白細胞介素-13(IL-13)的定量檢測為Milliplex Cytokine Panel板(意大利)上機檢測。

1.7 Western blot

用含0.1%苯甲磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液在冰上裂解細胞20 min, 細胞收集于1.5 mL EP管并離心，然后將上清液轉移至無菌EP管中。使用BCA 蛋白檢測法測量樣品中的蛋白質濃度。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離相同質量的蛋白質，并轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)。將蛋白質與含5%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)在室溫下孵育1 h, 然后與一抗在4 ℃下孵育2 h, 孵育結束, 1×TBST洗3次，每次15 min。用1×TBST稀釋HRP標記的二抗(Proteintech), 稀釋比例1∶3 000, 將稀釋后的二抗[山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab6721, 1∶10 000, Abcam)]與膜共同孵育45～60 min。孵育結束, 1×TBST洗3次，每次15 min。使用ECL化學發光液(Thermo)與膜孵育3 min, 用吸水紙吸盡液體在天能觀膠儀進行檢測拍照。以β-actin為內參，使用Bandscan 5.0軟件分析蛋白條帶，檢測表達水平。

1.8 統計學分析

使用GraphPad Prism軟件6.0對結果進行繪制分析。使用t檢驗分析比較2組間的差異。使用單因素方差分析比較3組間的差異。結果表示為平均值±標準偏差。P<0.05為差異有統計學意義。所有實驗均重復3次。

2 結 果

2.1 動物行為改變情況

與對照組比較，模型組小鼠在激發期出現不同程度的鼻翼煽動和呼吸急促、食欲下降的現象。此外，個別小鼠出現腹肌抽搐及口唇紫紺等癥狀。治療組小鼠在激發期有鼻翼煽動和呼吸急促表現，但未發現腹肌抽搐、口唇紫紺及食欲下降等癥狀，并且呼吸急促表現未隨激發時間的延長而進一步加重。對照組小鼠在整個處理過程中無異常表現。

2.2 肺組織損傷情況

HE染色及巨噬細胞(CD68)染色結果顯示，與對照組相比，模型組炎性細胞浸潤及組織纖維化程度更加嚴重，而治療組巨噬細胞浸潤程度改善，3組相對炎性評分比較，差異具有統計學意義(P<0.05); Masson染色結果顯示治療組可顯著改善哮喘模型導致的纖維化程度。見圖1。

A: 3組HE染色、CD68染色、Masson染色圖(放大倍數200倍); B: 3組相對炎性細胞評分; C: 3組相對上皮基底膜厚度。與對照組比較, *P<0.05; 與模型組比較, #P<0.05。圖1 各組肺組織形態學改變及巨噬細胞浸潤情況

2.3 氣道反應性檢測

氣道反應性由侵入性呼吸系統對乙酰甲膽堿的抵抗力決定。與對照組相比，模型組呼吸系統氣道阻力的劑量反應曲線增加。治療組通過胃饑餓素的治療顯著降低了哮喘小鼠的呼吸系統的阻力(P<0.05)。見圖2。

與對照組比較, *P<0.05; 與模型組比較, #P<0.05。圖2 各組氣道反應性檢測

2.4 白細胞和炎性細胞因子的表達

模型組中哮喘模型鼠的BALF中總白細胞(圖3A)以及嗜酸性粒細胞(圖3B), 淋巴細胞(圖3C)和嗜中性白細胞(圖3D)顯著增加(P<0.05); 與模型組相比，治療組白細胞總數顯著降低(P<0.05)。模型組哮喘小鼠的BALF中的TNF-α(圖4A)、IFN-γ(圖4B)、IL-5(圖4C)和IL-13(圖4D)水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。治療組通過胃饑餓素治療后，TNF-α、IFN-γ、IL-5及IL-13表達水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各處理組炎癥因子表達情況 pg/mL

A: 總細胞數量; B: 嗜酸性粒細胞; C: 淋巴細胞; D: 中性粒細胞。

A: TNF-α表達情況; B: IFN-γ表達情況; C: IL-5表達情況; D: IL-13表達情況。

2.5 胃饑餓素通過減少細胞焦亡治療小鼠哮喘

免疫組化顯示, NLRP3小體在肺組織中表達。治療組經過胃饑餓素治療后，肺組織中NLRP3表達量顯著降低(P<0.05)。Westen Blot顯示，治療組在胃饑餓素治療后, NLRP3、Caspase-1及白細胞介素-1B(IL-1B)表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖5。

A: 免疫組化檢測NLRP3(放大倍數200倍); B: NLRP3、Caspase-1、IL-1B免疫印跡條帶; C: NLRP3、Caspase-1、IL-1B表達水平量化。與對照組比較, *P<0.05; 與模型組比較, #P<0.05。圖5 各組細胞焦亡情況檢測

3 討 論

本研究通過構建小鼠哮喘模型，成功驗證胃饑餓素治療能夠明顯改善哮喘所致的炎癥反應和肺組織纖維化的作用。此外，通過探討細胞焦亡在胃饑餓素治療哮喘的機制發現，胃饑餓素能夠通過減輕哮喘所致細胞焦亡的程度，從而起到治療哮喘的作用，這為今后的哮喘治療提供了新的思路，并為未來靶向治療提供了理論依據。由OVA引起的支氣管哮喘小鼠模型是經典的哮喘動物模型，具有組織病理學和氣道高反應性的特征[8]。本試驗中, OVA處理的小鼠表現出明顯的病理性氣道改變和高反應性，而經過胃饑餓素治療后均可有效改善這些呼吸系統癥狀。這些結果表明，胃饑餓素能夠有效治療哮喘導致的呼吸系統改變現象。研究[9-11]表明，胃饑餓素在抑制膿毒癥、燒傷和飲食引起的能量代謝失衡時，可以抑制TNF-α和IFN-γ的表達，與本研究結果類似。本研究中，由OVA誘發的哮喘小鼠模型的BALF中，胃饑餓素顯著抑制了TNF-α和IFN-γ水平的升高。目前，已知TNF-α和IFN-γ既是炎癥反應標志物，又是參與哮喘發展的關鍵細胞因子[12]。本研究結果顯示，胃饑餓素可能抑制這些炎癥因子的表達，進而改善哮喘。

細胞焦亡表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內容物釋放，激活強烈的炎癥反應[3]。其主要通過炎癥小體介導的Caspase-4、5、11的激活，造成包括GSDMD在內的多種Gasdermin家族成員發生剪切和多聚化，造成細胞穿孔，進而引起細胞死亡[4]。NLRP3炎性小體及Caspase-1的表達能夠反映細胞焦亡的程度[13-14]。此外, NLRP3炎性小體能夠影響下游GSDMD，進一步促進細胞焦亡的發生[15]。哮喘是一種炎癥相關性疾病，且細胞焦亡與炎癥緊密相關，故本研究探討了細胞焦亡在哮喘中的機制。本研究進一步檢測了NLRP3和Caspase-1的表達情況，結果顯示小鼠哮喘模型發生細胞焦亡的程度較重，施加胃饑餓素治療后能夠明顯改善細胞焦亡程度，提示胃饑餓素可能是通過減輕細胞焦亡程度，從而發揮治療哮喘的作用。然而，本研究并未對引發焦亡的深入機制進行探討，作者在未來的研究中會關注其作用機制的改變情況。

綜上所述，本研究表明，胃饑餓素可以通過減輕細胞焦亡程度，改善呼吸系統中的炎癥反應，進而治療哮喘，提示胃饑餓素可能是治療哮喘的新的藥物靶標。