剩余污泥資源化提取蛋白質方法的優選

潘倩，劉艷梅，周賢棟，潘學軍，楊本芹

(昆明理工大學 環境科學與工程學院，昆明 650500)

剩余污泥是指污水處理廠在對污水進行生化處理時產生的不同廢棄物的混合物。近年來，隨著污水處理量的不斷增多，剩余污泥的產量也逐年上升，預計2020年—2025年間，污泥的年產量有望突破6 000萬t(以含水率80%計算)[1]。研究表明，剩余污泥的處理處置費用高達整個污水廠總運行費用的65%[2]，超過80%的污泥因處理不當成為環境的二次污染源[3]。因此，將污泥進行有效處理，以減少其對環境的污染是目前水處理行業發展的重中之重。

剩余污泥中含有大量蛋白質(約占污泥總量的30%～60%)，充分利用其中的蛋白質，一方面可以達到污泥資源化的目的，另一方面還能減輕剩余污泥對環境的危害[4]。蛋白質資源化途徑包括動物飼料、木材粘合劑、泡沫滅火劑以及混凝土發泡劑等。Hwang等[5]發現，在污泥中提取出來的蛋白質重金屬含量低于法定標準，檢測結果中也不含黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和沙門氏菌D組等有毒有害物質，且對其進行白鼠試驗無明顯影響，證實其應用于動物飼料具有可行性。Pervaiz等[6]發現，從污泥中回收的蛋白質較未處理的污泥抗剪強度有很大提升，有作為木材粘合劑的巨大潛能。Li等[7]發現，對啤酒廠污泥進行處理后，其中提取出的蛋白質可作為復合蛋白發泡劑使用。由此可見，剩余污泥中提取回收的蛋白質有很大的利用空間。

截至目前，剩余污泥中蛋白質的提取技術還未得到廣泛應用，其原因主要是效率低、不經濟。污泥預處理是目前使用最多的提高蛋白質溶出效率的方法，其中主要包含熱預處理[8]、堿預處理[9]、臭氧預處理[10]、超聲預處理[11]、酶預處理[12]以及其中幾種處理方式形成的聯合預處理。在單獨預處理方式中，不同的預處理方式都存在其相應的缺點，例如，熱預處理能耗較高，堿預處理對儀器腐蝕較大，臭氧預處理適用范圍過窄，超聲預處理難以應用到實際工程中等[13]。聯合預處理是基于不同預處理方式的作用條件，充分考慮其協同作用，進一步提高污泥細胞的溶解效率的一種高效預處理方法。目前，大部分研究者對單獨的預處理提取蛋白質進行了許多條件優化，但很少有對不同預處理方法進行比較并對所提取的蛋白質進行純化回收的研究。

筆者采用熱堿聯合預處理[14]、超聲堿聯合預處理[15]和溶菌酶預處理[16]3種預處理方法，通過對溶出蛋白質濃度進行分析，探究其發揮破胞作用的最優條件，并分別比較3種方法提取蛋白質的效果，最后優化等電點法，確定回收純化蛋白質的最佳pH值，旨在為污泥中蛋白質的提取利用提供相應參考。

1 材料與方法

剩余污泥取自昆明市污水廠的污泥濃縮池，該廠內采用A2/O(Anaerobic-Anoxic-Oxic)工藝進行污水生物處理。剩余污泥主要理化性質如表1所示。

表1 污泥基本性質Table 1 Characteristics of raw sludge

試驗以蛋白質濃度為主要指標來確定各項預處理方法的最優破胞條件。原始污泥總蛋白濃度使用凱氏定氮法[17]測定，離心后的上清液中蛋白質采用BCA蛋白質試劑盒[18]結合酶標儀(MultiskanTMFC，賽默飛世爾科技)測定。

凱氏定氮法蛋白質計算見式(1)。

(1)

式中：X為蛋白質含量，g/(100 g)；V1為試液消耗鹽酸標準滴定液的體積，mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標準滴定液的體積，mL；c為鹽酸標準滴定液的濃度，mol/L；m為試樣的質量，g；V3為吸取消化液的體積，mL；F為氮換算為蛋白質的系數，取6.25。

2 試驗設計

將污水廠所取剩余污泥濃度調至約20 000 mg/L，然后分別進行試驗。

2.1 熱堿破解剩余污泥試驗

熱堿破解污泥試驗主要從pH值、溫度、時間3個影響因素來考察污泥溶胞效果，設置如下單因素試驗:

1)pH優化試驗。 參照崔靜等[19]和翟世民等[20]的研究，在破胞溫度為140℃、時間為2 h的條件下，在5個燒杯中分別取100 mL的剩余污泥，用4 mol/L的NaOH溶液將pH值分別調至9、10、11、12和13后在恒溫箱(XMTD-8222，上海精宏實驗設備有限公司)中進行溶胞，優化出最優pH值。

2)溫度優化試驗。 在6個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，恒溫箱溫度分別調節為100、120、140、160、180、200 ℃，在優化得到的最優pH值條件下破胞2 h，得到最優溫度。

3)時間優化試驗。 在6個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，在得到的最優pH值和溫度下，分別破胞0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，若此步優化得出的試驗結果與前兩步優化時所用時間不一致，則用該步驟得到的最優時間重復前兩個步驟，得出最終試驗結果。

2.2 超聲-堿聯合破解污泥試驗

超聲聯合堿破解污泥試驗主要從pH值、超聲功率、超聲時間3個影響因素考察污泥破胞效果，設定如下單因素試驗：

1)pH值優化試驗。 參照康曉榮[21]的研究，在溶胞功率為3 W/mL(超聲期間超聲3 s停1 s)、時間為30 min的條件下，在5個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，用4 mol/L的NaOH溶液調節pH值，依次為9、10、11、12和13，進行破胞，優化出最優pH值。

2)功率優化試驗。 在6個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，在最優pH值條件下調節超聲功率，依次為1、2、3、4、5、6 W/mL，破胞30 min，優化出最優功率。

3)時間優化試驗。 在5個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，在得到的最優pH值和超聲功率條件下依次破胞10、20、30、40、50 min，若此步優化得出的試驗結果與前兩步優化時所用時間不一致，則用該步驟得到的最優時間重復前兩個步驟，得出最終試驗結果。

2.3 溶菌酶破解污泥試驗

溶菌酶(溶菌酶凍干粉，北京索萊寶科技有限公司)破解試驗主要從pH值、酶濃度、處理時間3個影響因素來考察污泥的破胞效果，設定如下單因素試驗：

1)pH值優化試驗。 溶菌酶試驗參照陸鈞皓[22]的研究，在12個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，其中6個保持酶濃度在200 mg/g，依次調節pH值為4、5、6、7、8、9，于室溫下破胞4 h；另外6個在不加酶的情況下，依次調節pH值為4、5、6、7、8、9，于室溫下破胞4 h；依據兩者差值即可分析酶單獨作用時的最優pH值。

2)酶濃度優化試驗。 在7個燒杯中分別取100 mL等濃度的剩余污泥，依次調節燒杯酶濃度為60、90、120、150、200、250、280 mg/g，在確定的最優pH值和室溫下破胞4 h，優化出最優酶濃度。

3)時間優化試驗。 在7個燒杯中分別取100 mL等濃度的剩余污泥，調節酶濃度及pH值為確定的最優值，室溫下依次反應2、3、4、5、6、7、8 h，若此步優化得出的試驗結果與前兩步優化時所用時間不一致，則用該步驟得到的最優時間重復前兩個步驟，得出最終試驗結果。

經以上每種因素預處理后的污泥溶液均在8 000 rpm高速冷凍離心機上離心20 min，離心后上清液過0.45 μm濾膜，取濾液進行蛋白質的濃度測定，以得到高效經濟的預處理方法及其最優作用條件。

2.4 溶菌酶對提取后蛋白質的影響

以熱堿預處理為例，測定熱堿預處理后的蛋白質溶液，得到蛋白質濃度值P1。再分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g的溶菌酶凍干粉加入100 mL水中，得到6種不同濃度的溶菌酶溶液，測定蛋白質濃度依次為Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6。取預處理后的蛋白質溶液，分別與6種配制溶菌酶溶液各5 mL進行混合，得到10 mL不同濃度蛋白質混合液，測定蛋白質濃度依次為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6。最后檢驗等式(2)是否成立，以探究溶菌酶對提取后蛋白質濃度的影響。

(2)

式中，x的取值范圍為1～6。

2.5 等電點回收蛋白質試驗條件優化

將試驗得到的上清液稱為蛋白溶液。在6個燒杯中分別取100 mL 蛋白溶液，利用2 mol/L的硫酸溶液調節其pH值，依次為1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5，然后于-4 ℃冰箱靜置1.5 h，將靜置后的蛋白溶液于8 000 rpm下離心20 min，得到的上清液過0.45 μm濾膜，取部分濾液分別進行蛋白質濃度測定，剩下的濾液再分別通過纖維素透析袋(截留分子量20 000 Da)純化備用。

3 結果與討論

3.1 熱堿預處理參數的確定

如圖1(a)所示，隨著pH值的升高，溶液中蛋白質濃度逐漸升高，在pH為12～13區間顯著增加。當pH=13時，溶液中蛋白質濃度達到最大值2 515.55 mg/L(考慮到堿性過高對污泥處理實際意義不大，較高pH值會使污泥產生大量褐變反應[23]，使其中小分子發生聚集，預處理效果反而會降低，故將pH=13設為最大值)。這說明當pH<12時，污泥細胞的溶解程度不高，當pH>12時，污泥溶胞率明顯上升。在高溫的協助作用下，強堿可以與細胞中的脂類物質發生皂化反應[24]，加速破壞污泥中的細胞結構。除此之外，強堿具有化學和電離的雙重作用，更容易使污泥中的微生物細胞發生溶解，進而使胞內物質溶出[25]，故選取pH值為13為最佳堿強度。

如圖1(b)所示，熱堿處理中蛋白質濃度隨著溫度的升高而逐漸升高，在140 ℃時達到最大值1 810.87 mg/L，當溫度超過140 ℃后，蛋白質濃度呈下降趨勢。熱堿處理過程中，隨著溫度的升高，污泥中的微生物絮體結構開始分散，細胞壁和細胞質也在高溫的作用下溶解，導致細胞內大量有機物溶出。大分子蛋白質也在高溫作用下變成小分子蛋白質，使溶液中蛋白質濃度逐漸升高[26]。與此同時，在堿性條件下，過高的溫度會使蛋白質水解為氨基酸，β-氨基酸是其主要成分，而β-氨基酸在高溫條件下會發生脫氨反應，生成氨氣和不飽和羧酸鹽，在強堿條件下，氨氣會從溶液中溢出故溶液中溶解性蛋白質的濃度會降低[27]。

圖1(c)所示為熱堿預處理時間對蛋白質濃度的影響，熱堿處理前期，溶液中蛋白質濃度隨時間逐漸增加，在處理時間為1.5 h時達到最大值2 068.46 mg/L，后期隨著時間的增加，蛋白質濃度緩慢下降。這是因為在熱堿反應中胞內物質的釋放和蛋白質的水解是同時進行的，在前1.5 h，參照Fan等[28]的試驗結論，因為細胞內物質釋放速率大于蛋白質的堿性水解作用，故蛋白質濃度呈現上升趨勢，1.5 h后，蛋白質的水解速率大于胞內蛋白質溶出速率，故蛋白質濃度呈現下降趨勢。Li等[29]的研究結果表明，堿破解污泥細胞的過程分為快速和慢速階段，大部分的胞內有機物質會在前30 min被釋放出來，因此，考慮到經濟和溶胞效果，選取1.5 h為最佳預處理時間。

圖1 熱堿提取中pH值、溫度及時間與溶液中 蛋白質濃度的關系Fig.1 pH value, temperature and time in relation to protein concentration in solution during the

以上3個單因素試驗結果確定了熱堿處理的最優條件為：pH值13、時間1.5 h、溫度140 ℃，與預設條件存在相應誤差，可能是因為污泥性質和試驗條件的差異。考慮到試驗誤差情況，取三者蛋白質最大濃度的平均值，即熱堿預處理在最佳條件下可使溶液中蛋白質濃度達到2 062.98 mg/L。

3.2 超聲-堿聯合預處理參數的確定

由圖2(a)可知，在超聲聯合堿預處理污泥時，堿的強度至關重要。當pH<12時，隨著堿強度的增加，溶液中蛋白質濃度不斷增加，在pH值為12時達到最大值488.73 mg/L，當pH>12時，蛋白質濃度開始下降。因為超聲波具有破壞污泥絮體結構的作用，當聲波能量達到一定值時，污泥絮體結構分散，加大污泥顆粒與堿的接觸面積，提高堿對細胞壁的破壞作用，堿性越強對污泥的溶胞效果越明顯[30]。但在超聲作用下，堿性過強會加快溶液中部分有機物的分解，進而導致溶液中蛋白質含量降低。

圖2(b)顯示，在預處理時間為30 min、pH值為12的條件下，當功率為1 W/mL時，蛋白質濃度達到388.35 mg/L，當功率繼續增加至4 W/mL時，蛋白質濃度逐漸降低，但當功率為5 W/mL時，蛋白質濃度迅速增加至最大值497.89 mg/L，后期隨著功率的增加，蛋白質濃度再次呈下降趨勢。超聲波在聯合堿預處理時，主要憑借其空化作用[31](通過剪切液體形成空化核)和聲化學作用[32](通過超聲波加速反應的進行或產生新的化學物質)達到溶胞的目的。在功率由1 W/mL增加到4 W/mL的階段，蛋白質濃度降低的原因可能是污泥絮體粒徑過大，堿未能很好地發揮作用，超聲功率的增加反而加快了蛋白質的水解速率。超聲與堿聯合作用時存在最適功率和最佳粒徑的說法[33]，只有污泥經過一定功率的超聲后，在剪切作用下分散成最佳粒徑大小，這時堿才能發揮其最大破壞作用使細胞內容物流出。試驗證明了5 W/mL為該試驗條件下的最優功率。

如圖2(c)所示，當時間小于30 min時，蛋白質濃度隨著時間的增加呈現上升趨勢，30 min時達到499.48 mg/L，30 min以后蛋白質濃度趨于平穩。在試驗前期，超聲波和堿同時起作用，加速了污泥絮體結構的分解和細胞壁的破碎，促使蛋白質濃度不斷增加。但反應持續一段時間后，一方面由于堿的消耗導致堿性下降，未能起到跟初期相同的堿解作用，另一方面超聲波單獨作用時破解細胞需要的能量更大，隨著堿解作用的降低，單獨的超聲作用只能破壞很小一部分污泥細胞，導致后期蛋白質濃度不再有明顯增加[34]。

圖2 超聲聯合堿提取中pH值、功率及時間與溶液中 蛋白質濃度的關系Fig.2 pH value,power and time in relation to protein concentration in solution during the ultrasonic-alkali

試驗結果確定了超聲聯合堿預處理的最佳條件為：pH值12、功率5 W/mL、時間30 min。相同地，考慮到試驗誤差取三者蛋白質最大濃度的平均值，即在超聲聯合堿預處理的最優作用條件下可使溶液中蛋白質濃度達到497.76 mg/L。

3.3 溶菌酶預處理參數的確定

在酶濃度為200 mg/g、時間為6 h的條件下，在pH值跨度4～9的條件下試驗研究了pH值的單獨作用效果，同時，以相同pH值跨度研究溶菌酶的作用效果，兩者的差值即為溶菌酶單獨作用時的效果。如圖3(a)差值變化曲線所示，當pH值等于7時，酶單獨起作用時溶液中蛋白質濃度達到241.06 mg/L，且高于其他任何pH值下的濃度。pH值是影響溶菌酶水解污泥的一個重要因素，過酸或過堿都會對酶發揮其最大活性產生影響。酶分子在不同的pH值溶液中具有不同解離狀態，固定的某種解離狀態只能與一種底物結合酶活性才能達到最高。除此之外，pH值也會影響酶分子中某些基團的解離，酶底物的專一性、酶分子活性中心的構象等都會影響這些基團的解離狀態，進而影響酶的活性[35]。

圖3 溶菌酶提取中pH值、酶濃度及時間與溶液中 蛋白質濃度的關系Fig.3 pH value, enzyme concentration and time in relation to protein concentration in solution

如圖3(b)所示，當酶濃度較低時，溶液中蛋白質濃度隨著酶濃度的增高而增高，后期隨著酶濃度的增高，蛋白質濃度增加趨勢較為平緩。當溶菌酶濃度為200 mg/g時，溶液中蛋白質濃度達到最高值297.14 mg/L。這是因為隨著前期酶濃度的增加，底物開始與酶接觸反應，促使大量的有機物質由固相轉移到液相中，使得溶液中蛋白質濃度逐漸升高。但當反應體系中所有底物與所投加溶菌酶充分接觸后，底物幾乎已全部與酶分子結合形成絡合物[36]，故當酶量增加時，溶液中蛋白質濃度不再顯著增加。

如圖3(c)所示，當反應時間小于6 h時，隨著反應時間的增加，溶液中蛋白質濃度逐漸增加，在6 h時達到271.65 mg/L，當反應時間大于6 h時，蛋白質濃度呈明顯降低的趨勢。反應時間是酶發揮活性的一個重要因素，只有當在酶與底物充分接觸，充分反應之后，污泥才能最大程度地釋放其內含物，進而使得溶液中蛋白質濃度上升。在反應的前6 h內，在外界振蕩和恒溫條件下，酶與剩余污泥不斷反應，使得污泥被水解并釋放出大量胞內物，導致溶液中蛋白質濃度上升，當大于6 h后，溶菌酶已與底物充分接觸反應，此時蛋白質的水解速度大于其釋放速度，進而溶液中蛋白質濃度呈下降趨勢。

由以上3個因素影響試驗確定溶菌酶預處理的最優條件為：pH值7、酶濃度200 mg/g，時間6 h，在最優作用條件下，可使溶液中蛋白質濃度達到269.95 mg/L。

通過對3種方法的結果對比，得出熱堿法(2 062.98 mg/L)>超聲聯合堿法(497.76 mg/L)>溶菌酶法(269.95 mg/L)，故選取熱堿法進行下一步試驗。

經過預處理后的蛋白質可能會發生部分變性，但不影響后期對提取蛋白質粘度特性[37]，故暫時不用考慮蛋白質變性對試驗結果的影響。

3.4 溶菌酶對提取后蛋白質的影響結果

如圖4所示，A、B、C、D、E、F分別代表提取蛋白質溶液分別與0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/mL的溶菌酶溶液混合得到的蛋白質濃度理論值與實際值。由圖4可以看出，理論值與實際值差距很小，幾乎可以忽略，溶菌酶對提取蛋白質濃度幾乎無影響。溶菌酶的作用機制主要是針對細胞壁上的肽聚糖，通過肽鍵上的活性部位水解切斷N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間的β-1,4糖苷鍵，從而達到破壞細胞壁的作用，對蛋白質沒有破壞作用，這與試驗得出的結論一致[38]。

圖4 熱堿處理提取蛋白質溶液與不同濃度溶菌酶 溶液混合后蛋白質濃度的理論值與實踐值Fig.4 Theoretical and practical values of protein concentration after thermal-alkali treatment with different concentration of lysozyme

3.5 等電點回收蛋白質試驗結果

圖5顯示了由熱堿法提取的上清液采用等電點法回收蛋白質隨pH值的影響，蛋白質回收率隨pH值的增加呈先上升后下降的趨勢，當pH值為3時，蛋白質的回收率達到最大值62.42%。蛋白質是由多種氨基酸連接而成的生物大分子，兩性電解質，在偏酸和偏堿溶液中會分別帶正電和負電。通過調節pH值的大小可破壞或削弱分子表面的水化膜和雙電層，使分子間引力增加，進而降低蛋白質在溶液中的溶解度，變為沉淀析出[39]。Hwang等[5]發現，在pH值為3.3時城市污泥蛋白質回收率最高，其結論與本研究相符。

圖5 熱堿處理后污泥固體量和溶液中溶解性蛋白質 的變化及pH值對蛋白質回收率的影響Fig.5 Changes in sludge solids and soluble protein of solution after thermal-alkali pretreatment and effect of pH on protein recovery

4 結論與展望

采用熱堿法、超聲-堿聯合法、溶菌酶法分別對剩余污泥進行預處理，得出最優預處理條件，對比提取效率可看出：熱堿法(pH值13、溫度140 ℃、時間1.5 h，2 062.98 mg/L)>超聲聯合堿法(pH值12、功率5 W/mL、時間30 min，497.76 mg/L)>溶菌酶法(pH值7、酶濃度200 mg/g、時間6 h，269.95 mg/L)，對熱堿法提取的上清液采用等電點法回收蛋白質，在pH值為3時蛋白質的回收率最高，為62.42 %。

剩余污泥中的蛋白質具有較大的利用潛能，但目前蛋白質的提取方法仍存在能耗大、二次污染等問題，許多技術和應用環節還不夠成熟，仍需要不斷完善。因此，在剩余污泥蛋白質的提取及應用上還可開展大量的研究工作。