核桃肽制備工藝的優化及其改善記憶功能研究

成 靜，陳大偉，曲 敏，于 蘭，莫朝輝

（1.武漢天天好生物制品有限公司，湖北武漢 430090；2.湖北省疾病預防控制中心食品藥品安全評價中心，湖北武漢 430000）

核桃別名羌桃,胡桃屬于胡桃科胡桃屬，我國核桃栽培資源豐富,培歷史悠久，種植范圍廣泛，核桃產量位居世界之首[1]。核桃富含蛋白質、脂肪、膳食纖維、微量元素和維生素等，其中蛋白質占比為15%～25%，最高可達29.7%。核桃蛋白中氨基酸種類齊全，人體八種必需氨基酸含量豐富且構成比例接近人體所需，屬于優質蛋白[2]。近年來，研究顯示核桃不僅具有豐富健腦益智、降脂、抗衰老等保健功效，對于預防和輔助治療心血管疾病、癌癥等慢性非傳染性疾病也有一定作用[3]。

外源性生理活性多肽因具有分子量小、無抗原性、易于吸收等優點，引起研究人員的重視并獲得市場的廣泛認可。目前我國核桃肽生產主要以核桃粕為原料，采用堿溶酸沉法、酶解法[4]、反膠束法[5]、發酵法[6]、超聲輔助法[7]等多種工藝制備，其中酶解法具有反應條件溫和、專一性強、效率高、產品純度高等優點，成為目前制備核桃肽的主要方法。核桃種皮是一層包裹在核桃仁表面的呈黃色或淺黃色的薄膜，研究顯示核桃種皮中富含植物多酚及色素，可產生明顯澀味口感，影響核桃加工產品的品質[8?10]。但值得注意的是目前對核桃肽酶解制備工藝進行研究的主要評價指標依然是蛋白質水解度、多肽分子量以及蛋白質、多肽含量[11]，對于核桃種皮對核桃肽品質的影響相關研究甚少。

本研究以核桃粕為原料，采用單因素及正交試驗對核桃肽酶解工藝進行探討，在保證產品蛋白質含量、多肽含量以及多肽分子量等指標的前提下，去除由于核桃種皮引起的產品顏色深暗問題，得到最佳的淺色核桃肽制備工藝，并對其改善記憶力功能進行試驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃粕 由武漢輕工大學提供；堿性蛋白酶（酶活2.4 AU/g）、中性蛋白酶（酶活0.8 AU/g）、風味蛋白酶（酶活1000 LAPU/g） 諾維信（中國）生物技術有限公司；木瓜蛋白酶（酶活6×105U/g） 東恒華道生物科技有限責任公司；鹽酸、檸檬酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；SPF級昆明雌性小鼠 湖北省實驗動物研究中心（SCXK（鄂）2015-0018）；動物飼料 武漢萬千佳興生物科技有限公司（SCXK（鄂）2011-0011）。

JE1002電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋 常州國華儀器制造有限公司；DZF-6050真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；UPT-K1600凱氏定氮儀 優普通用公司；S433D氨基酸分析儀 德國Sykam公司；T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；ZH-1型小鼠水迷宮系統 安徽正華生物設備有限公司；YLS-3TB型小鼠跳臺儀 安徽正華生物設備有限公司；ZH-600型小鼠避暗儀 安徽正華生物設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃肽制備工藝 將核桃粕與水按照一定料液比混合，加入一定濃度檸檬酸，在90 ℃條件下保持30 min，過濾收集沉淀，將沉淀水洗至中性加水調節料液比，加入蛋白酶酶解，滅酶，過濾收集濾液，濃縮，噴霧干燥制備核桃肽。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 不同濃度檸檬酸前處理對核桃肽制備的影響 將核桃粕與水按照料液比1:10混合，分別加入占底物質量濃度的0、0.5%、1%、2%、4%檸檬酸，90 ℃變性處理30 min，去除上清后水洗至中性，5%堿性蛋白酶，55 ℃酶解4 h制備核桃肽。探討不同濃度檸檬酸前處理對核桃肽透光率、多肽含量以及核桃肽收率的影響。

1.2.2.2 不同蛋白水解酶對核桃肽制備的影響 將核桃粕與水按照料液比1:10混合，采用2%檸檬酸前處理，方法同1.2.2.1；分別加入底物濃度5%的中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶，酶解4 h，制備核桃肽。探討不同蛋白水解酶對核桃肽收率的影響。

1.2.2.3 不同料液比對核桃肽制備的影響 將核桃粕與水按照料液比1:5、1:10、1:15、1:20進行混合，采用2%檸檬酸前處理，方法同1.2.2.1；加入5%堿性蛋白酶，酶解4 h，制備核桃肽。探討不同料液比對核桃肽收率的影響。

1.2.2.4 不同酶添加量對核桃肽制備的影響 將核桃粕與水按照料液比1:15進行混合，采用2%檸檬酸進行前處理，方法同1.2.2.1分別加入1%、2%、4%、6%堿性蛋白酶，酶解4 h，制備核桃肽。探討不同酶添加量對核桃肽收率的影響。

1.2.2.5 不同酶解時間對核桃肽制備的影響 將核桃粕與水按照料液比1:15進行混合，采用2%檸檬酸進行前處理，方法同1.2.2.1加入4%堿性蛋白酶，分別酶解2、4、6、8 h，制備核桃肽。探討不同酶解時間對核桃肽收率的影響。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗的基礎上，依據單因素研究結果，選擇檸檬酸濃度、酶添加量、料液比以及酶解時間為研究因素，以核桃肽收率為評價指標進行核桃肽制備工藝優化。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 多肽含量的測定 參照GB/T 22492-2008《大豆肽粉》附錄B肽含量的測定方法[12]。

1.2.5 收率的測定 核桃粕經酶解過濾，收集濾液濃縮、真空干燥，收集干燥粉末并稱取質量，與核桃粕質量進行對比計算核桃肽收率（下文簡稱“收率”）。

1.2.6 透光率的測定 將樣品用蒸餾水配制10%濃度溶液，空白為蒸餾水，分別在波長600、450 nm處測定透光率，并以T600及T450表示測定結果，每個樣品重復三次，取平均值[13?14]。

1.2.7 受試動物分組及服用劑量設計 以SPF級昆明雌性小鼠為受試動物，設置低、中、高三個劑量組及空白對照組，灌胃劑量分別為1.33、2.66、3.99 g/kg BW，空白對照組灌胃蒸餾水處理，各劑量組受試動物10只。受試動物連續灌胃30 d，末次灌胃后24 h開始測試。

1.2.8 水迷宮試驗 迷宮泳道水深9 cm，水溫20 ℃，受試動物訓練時間限定120 s，在120 s內未達到終點的受試動物均記為120 s。具體實驗方法參照文獻《保健食品檢驗與評價技術規范》2003版輔助改善記憶功能檢驗方法[15]。

1.2.9 跳臺試驗 末次灌胃后24 h開始訓練，具體實驗方法參照文獻《保健食品檢驗與評價技術規范》2003版輔助改善記憶功能檢驗方法[15]。

1.2.10 避暗試驗 末次灌胃后24 h開始訓練，具體實驗方法參照文獻《保健食品檢驗與評價技術規范》2003版輔助改善記憶功能檢驗方法[15]。

1.3 數據處理

采用SPSS 2.0軟件進行方差分析，按程序先進行方差齊性檢查，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計。錯誤次數、動物數等計數資料可用X2檢驗，四方表總例數小于40，或總例數等于或大于40但出現理論數等于或小于1時，改用確切概率法。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同濃度檸檬酸前處理對核桃肽制備的影響 由圖1～圖3可知，檸檬酸濃度范圍在0～4%制備的核桃肽其對應波長的透光率T600、T450隨著檸檬酸濃度增長而增大，T450越高，核桃肽溶液顏色越淺，T600越高，核桃肽溶液澄清度越高。檸檬酸濃度為2%時T600、T450為85.2%、76.8%，檸檬酸濃度為4%時T600、T450為88.1%、80.7%，即檸檬酸濃度為2%、4%進行前處理制備核桃肽產品溶液顏色較淺，澄清度較好，且檸檬酸濃度為2%時多肽含量最高為90.4%。核桃肽收率在檸檬酸濃度范圍0～4%時差異不明顯。結合產品溶液顏色、澄清度以及多肽含量指標，檸檬酸前處理的最佳濃度為2%。

圖1 不同濃度的檸檬酸前處理對核桃肽透光率的影響Fig.1 The effects of different concentrations of citric acid pretreatment on transmittance of walnut peptide

圖2 不同濃度的檸檬酸前處理對核桃肽多肽含量的影響Fig.2 The effects of different concentrations of citric acid pretreatment on walnut peptide content

圖3 不同濃度的檸檬酸前處理對核桃肽收率的影響Fig.3 The effects of different concentrations of citric acid pretreatment on walnut peptide yield

2.1.2 不同蛋白水解酶對核桃肽制備的影響 由圖4可知，采用堿性蛋白酶制備的核桃肽收率最高為36.1%，其次為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶。核桃肽制備工藝的最佳蛋白酶為堿性蛋白酶。

2.1.3 不同料液比對核桃肽制備的影響 由圖5可知，料液比范圍為1:5～1:20時，核桃肽收率隨著料液比增長而增長，當料液比為1:15其收率為33.1%，料液比1:20時收率為34.0%，增速明顯放緩。綜合能耗等相關因素，故選擇料液比1:15進行核桃肽制備。

圖4 不同蛋白酶類對核桃肽制備工藝的影響Fig.4 The effects of different proteases on the preparation process of walnut peptide

圖5 不同料液比對核桃肽制備工藝的影響Fig.5 The effects of different solid-liquid ratios on the preparation process of walnut peptide

2.1.4 不同酶添加量對核桃肽制備的影響 由圖6可知，酶添加量在1%～6%時，核桃肽收率隨著酶添加量增加而增加。加酶量4%時收率達到35.9%，加酶量6%時收率達到36.1%，加酶量到達4%后核桃肽收率增速明顯放緩，故選擇加酶量4%進行核桃肽制備。

2.1.5 不同酶解時間對核桃肽制備的影響 由圖7可知，酶解時間2～8 h內，核桃肽收率隨著酶解時間的延長而增加，酶解時間4 h收率達到34.3%，酶解時間6 h收率達到34.8%，酶解時間8 h收率達到35.0%，即酶解時間4、6、8 h收率差異不明顯，故選擇選擇酶解時間4 h進行核桃肽制備。

2.2 正交試驗

在單因素實驗的基礎上，以檸檬酸濃度（A）、酶添加量（B）、料液比（C）、酶解時間（D）為試驗因素，以核桃肽收率為指標，采用L16（45）正交設計探討不同因素對核桃肽制備工藝的影響，正交試驗結果如表2所示，方差分析結果如表3所示。

圖6 不同酶添加量對核桃肽制備工藝的影響Fig.6 The effects of different enzyme concentrations on the preparation process of walnut peptide

表2 正交試驗結果與分析Table 2 The results and analysis of orthogonal test

圖7 不同酶解時間對核桃肽制備工藝的影響Fig.7 The effects of different enzymolysis time on the preparation process of walnut peptide

由表2、表3可知核桃肽制備工藝中對核桃肽收率產生影響的各因素順序為B>D>C>A，酶添加量為顯著性影響因素（P<0.05）。核桃肽最優制備工藝為A3B4C3D3，即制備核桃肽的最佳工藝條件為：檸檬酸濃度2%、酶添加量6%、料液比1:15、酶解時間4 h。但kB3、kB4差異較小，經三次試驗驗證，A3B4C3D3制備核桃肽平均收率為34.1%，A3B3C3D3制備核桃肽平均收率為33.5%，差異不明顯，故選擇檸檬酸濃度2%、酶添加量4%、料液比1:15、酶解時間4 h作為核桃肽制備工藝。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.3 水迷宮試驗

核桃肽對水迷宮試驗小鼠記憶的影響結果如表4、圖8～圖10所示。各劑量組小鼠體重與空白對照組相比均無明顯改變，差異不具有統計學意義（P>0.05）。核桃肽對水迷宮試驗小鼠記憶獲得的影響結果顯示，與空白對照組相比較，各劑量組2 min內達到終點的動物數均明顯增多，且中劑量組與空白對照組差異具有顯著性（P<0.05）；中劑量組小鼠達到終點的時間及達到終點的錯誤次數均低于空白對照組，但差異不具有顯著性（P>0.05）。提示水迷宮試驗結果為陽性。

表4 核桃肽對小鼠體重影響（ ±s）Table 4 The effects of walnut peptide on body weight of mice ( ±s)

表4 核桃肽對小鼠體重影響（ ±s）Table 4 The effects of walnut peptide on body weight of mice ( ±s)

體重（g）組別增重（g）實驗前 試驗后空白對照組 21.2±0.6 35.6±2.5 14.4±2.3低劑量組 21.0±0.4 34.3±2.0 13.3±2.0中劑量組 21.1±0.9 35.1±4.5 14.0±3.7高劑量組 21.3±0.8 35.7±2.5 14.4±2.6

圖8 核桃肽對水迷宮試驗小鼠達到終點時間的影響Fig.8 The effects of walnut peptide on the time to reach the end point in water maze test

圖9 核桃肽對水迷宮試驗小鼠錯誤次數的影響Fig.9 The effects of walnut peptide on the number of errors in water maze test

圖10 核桃肽對水迷宮試驗小鼠達到終點的動物數的影響Fig.10 The effects of walnut peptide on the number of animals reaching the end in water maze test

2.4 跳臺試驗

核桃肽對跳臺試驗小鼠記憶的影響結果如表5、圖11～圖13所示。各劑量組小鼠體重與空白對照組相比均無明顯改變，差異不具有統計學意義（P>0.05）。跳臺試驗測驗期各劑量組錯誤次數均低于空白對照組，中、高劑量組潛伏期長于空白對照組；錯誤反應率低于空白對照組，但差異均不具有顯著性（P>0.05）。提示跳臺試驗結果為陰性。

表5 核桃肽對小鼠體重變化影響（ ±s）Table 5 The effects of walnut peptide on body weight of mice ( ±s)

表5 核桃肽對小鼠體重變化影響（ ±s）Table 5 The effects of walnut peptide on body weight of mice ( ±s)

體重（g）組別增重（g）實驗前 試驗后空白對照組 21.1±0.5 35.6±3.8 14.5±3.7低劑量組 20.9±0.7 34.9±3.3 14.0±3.5中劑量組 20.8±0.8 35.2±1.5 14.4±1.7高劑量組 21.1±0.5 34.9±3.0 13.8±3.2

圖11 核桃肽對跳臺試驗測驗期小鼠潛伏期的影響Fig.11 The effects of walnut peptide on latency in step-down test

圖12 核桃肽對跳臺試驗測驗期小鼠錯誤次數的影響Fig.12 The effects of walnut peptide on the number of errors in step-down test

圖13 核桃肽對跳臺試驗測驗期小鼠錯誤反應率的影響Fig.13 The effects of walnut peptide on error response rate in step-down test

2.5 避暗試驗

核桃肽對避暗試驗小鼠記憶的影響結果如表6、圖14～圖16所示。各劑量組小鼠體重與空白對照組相比均無明顯改變，差異不具有統計學意義（P>0.05）。避暗試驗測驗期高劑量組潛伏期明顯延長，錯誤次數及錯誤反應率明顯減少，與空白對照組比較，差異具有極顯著性（P<0.01）。提示避暗試驗結果為陽性。

表6 避核桃肽對小鼠體重變化影響（ ±s）Table 6 The effects of walnut peptide on body weight of mice ( ±s)

表6 避核桃肽對小鼠體重變化影響（ ±s）Table 6 The effects of walnut peptide on body weight of mice ( ±s)

體重（g）組別增重（g）實驗前 試驗后空白對照組 21.0±0.6 35.1±2.7 14.2±2.4低劑量組 20.7±0.9 34.2±2.6 13.5±2.7中劑量組 20.8±0.8 34.1±2.5 13.3±2.8高劑量組 21.3±0.4 35.5±4.4 14.2±4.4

3 結論與討論

圖14 核桃肽對避暗試驗測驗期小鼠潛伏期的影響Fig.14 The effects of walnut peptide on latency in passive avoidance test

圖15 核桃肽對避暗試驗測驗期小鼠錯誤次數的影響Fig.15 The effects of walnut peptide on the number of errors in passive avoidance test

圖16 核桃肽對避暗試驗測驗期小鼠錯誤反應率的影響Fig.16 The effects of walnut peptide on error response rate in passive avoidance test

核桃種皮富含多酚類物質，可在多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）作用下發生褐變反應，形成褐色化合物[16?17]，嚴重影響核桃深加工產品品質。本文采用核桃粕為原料，以產品收率及透光率為指標，探討核桃肽最佳制備工藝。在探索過程中，重點觀察了核桃種皮對產品顏色深淺度的影響及探索消除其不利因素的措施及手段。通過單因素實驗確定采用2%檸檬酸進行前處理制備的核桃肽T600、T450分別為85.2%、76.8%具有良好的澄清度，且產品顏色較淺，感官性能良好，其原因可能在于檸檬酸前處理降低了pH值，且檸檬酸可與銅離子螯合，抑制了PPO的活性[18]，同時90 ℃高溫環境的處理可破壞PPO催化活性，使其失活[19?23]，即加入檸檬酸以及90 ℃高溫前處理可抑制PPO活性或使其失活，有效抑制褐變反應發生減少褐色化合物生成。此時，核桃肽產品多肽含量最高為90.4%。正交試驗優化制備工藝，確定核桃肽最佳酶解制備工藝為前處理檸檬酸濃度2%、堿性蛋白酶添加量4%、料液比1:15、酶解時間4 h，核桃肽收率為33.5%。

同時本文采用水迷宮試驗、跳臺試驗以及避暗試驗探索核桃肽對受試小鼠對空間辨別學習能力和對回避性條件反射建立的影響。在水迷宮試驗中，以冷水作為刺激源，主要觀察小鼠的主動回避反應；而跳臺試驗是以電擊作為刺激源，屬于一次性刺激回避試驗，反應受試小鼠學習記憶能力保持的持久性及對外部刺激的敏感性；避暗試驗也是以電擊作為刺激源，屬于一種被動回避反應能力的測試，對小鼠的記憶再現能力有較高的敏感性[24]。本文試驗結果顯示中劑量組在水迷宮試驗中2 min內達到終點的動物數高于空白對照組且差異具有顯著性（P<0.05）；高劑量組在避暗試驗中潛伏期明顯延長，錯誤次數及錯誤反應率明顯減少且差異具有極顯著性（P<0.01）。說明核桃肽可以增強受試動物主動回避能力以及被動回避能力，即核桃肽具有促進改善記憶力的作用。這與目前已報道的類似研究結果一致，如樊永波等[25]對脫脂核桃粕研究顯示其對學習記憶具有促進作用，同時揭示富含精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的核桃蛋白也是增強學習記憶功能的有效成分[26?27]；趙海峰等[28]對核桃提取物研究也認為提取物中含有的瓜氨酸是信使分子NO產生的前體物質，具有促進神經元細胞的發育、成熟和神經遞質的傳導作用，從而改善受試動物的學習和記憶；杜倩等[29]對核桃肽的研究證實核桃肽可顯著提高機體抗氧化性，增強清除氧自由基的能力，減少不飽和脂肪酸的氧化損傷，促進腦發育，從而提升受試動物的學習記憶能力。

綜上所述，本文所述核桃肽制備工藝，不僅解決了核桃種皮導致核桃肽產品顏色過深的問題，在保證產品質量的同時還提升了產品感官的性能，終產品色淺、澄清度高，為其在多種劑型中的廣泛應用提供必備的條件，同時其能夠明顯促進小鼠學習記憶能力的生物活性功能更為其在改善神經系統功能產品的廣泛應用中提供科學依據。核桃肽改善記憶功能的機制將有待進一步深入研究。