樺褐孔菌多糖的分離純化及其抗氧化活性測定

李欣欣，李文香

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）又名樺樹菇,隸屬于真菌門、擔子菌亞門、傘菌綱、銹革孔菌目、銹革孔菌科、纖孔菌屬，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的藥用真菌[1]，素有“特殊的天然物質(zhì)”之稱。因其具有較強的抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力、促進益生菌增殖、降血糖等功效[2?9]，故深受廣大消費者青睞，在醫(yī)藥及保健品等領(lǐng)域具有極高的價值[10]。樺褐孔菌是一種生長在成熟樺樹樹干上的寄生真菌。主要分布在北緯45°～50°的地區(qū)，如北美北部、芬蘭、波蘭、俄羅斯西伯利亞、中國的黑龍江和吉林長白山、日本北海道等國家和地區(qū)[11]。樺褐孔菌子實體呈腫瘤形態(tài)（無菌塊狀），外表呈炭灰色，具有不規(guī)則的凹槽及裂痕，并且由堅硬和脆的物質(zhì)構(gòu)成，中心是淡黃色，可育部分為深褐色，前端開裂，孢子呈圓形或卵狀，且有剛毛[12]。

樺褐孔菌多糖最常見的提取方法為水提醇沉法[13?14]，此法具有操作簡易、耗能少、環(huán)保、不易破壞多糖結(jié)構(gòu)等優(yōu)勢。多糖分離純化分為除雜、分級兩個步驟。除雜指去除多糖中蛋白質(zhì)、色素及其他小分子化合物。分級指將粗多糖中分子量相近的單一組分分離開來。多糖具有較突出的抗氧化、抗腫瘤、抑菌等活性。大量研究發(fā)現(xiàn)，自由基與多數(shù)疾病的產(chǎn)生與發(fā)展都有著緊密聯(lián)系。自由基在人體中作為一種常見的中間介質(zhì)起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。正常狀況下，自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，只有自由基的數(shù)量保持恒定才能維持機體正常運行，動態(tài)平衡一旦破壞，就會引發(fā)各種疾病[15]。大量體內(nèi)和體外實驗證明食藥用真菌多糖是一種有效的抗氧化劑[16]。樺褐孔菌對人體健康益處歸功于其抗氧化成分和免疫增強成分。樺褐孔菌多糖是一種強抗氧化劑，用于消除DPPH和羥基自由基。本研究采用水提醇沉法提取樺褐孔菌粗多糖（Inonotus obliquusPolysaccharide，IOP），分離純化多糖組分，為樺褐孔菌多糖組分的后續(xù)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌菌塊 產(chǎn)于長白山；無水乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇、苯酚、硫酸、考馬斯亮藍、牛血清白蛋白、3,5-二硝基水楊酸等 均為國產(chǎn)分析純，購于天津希恩思生化科技有限公司。

LFP-800T高速多功能粉碎機 鉑歐五金制品有限公司；DK-626電熱恒溫水浴鍋 上海精宏有限公司；TGL-16C離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；SHB-Ⅲ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海精科實業(yè)有限公司；UV-5500可見-紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；ALPHA 2-4 LD plus 冷凍干燥機 德國Christ公司；1100高效液相色譜儀 美國Aglient公司；

1.2 實驗方法

1.2.1 樺褐孔菌化學(xué)組成 多糖含量測定：參考胡欣蕾等[17]的多糖含量的測定方式，利用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

還原糖含量的測定：參考王楠等[18]的測定方法，利用3,5-二硝基水楊酸法測還原糖含量。

蛋白質(zhì)含量的測定：參考王文平等[19]蛋白質(zhì)的測定方式檢測樺褐孔菌中蛋白質(zhì)的含量。

灰分含量的測定：520 ℃灼燒法，參照GB5009.4-2016

粗多糖提取率測定：粗多糖的提取得率（%）=（粗多糖重量/原料重量）×100

1.2.2 樺褐孔菌多糖的提取 樺褐孔菌菌塊干燥至恒重，粉碎機破碎，過60目篩處理備用。準確稱取樺褐孔菌菌粉50 g，料液比1:5于80 ℃提取三次，每次3 h，3500 r/min離心10 min后合并上清液，真空減壓濃縮至原體積的1/5，加入三倍體積的無水乙醇沉淀12～14 h，離心后凍干得樺褐孔菌粗多糖，并命名為IOP，此方法根據(jù)前期預(yù)實驗優(yōu)化所得。

1.2.3 粗多糖脫蛋白方法篩選 多糖脫除蛋白質(zhì)常用的方法有Sevage法、大孔樹脂洗脫法、聚酰胺吸附柱層析法等[20?21]，本實驗通過比較這些方法對多糖中蛋白質(zhì)脫除效果及多糖的保留效果，對多糖脫蛋白的方法進行挑選。

1.2.3.1 Sevage法 蛋白質(zhì)在氯仿等有機溶液中發(fā)生變性，根據(jù)這一特點將粗多糖水溶液中加入Sevage試劑（氯仿:正丁醇=4:1），體積比為3:1，磁力攪拌60 min，4000 r/min離心，保留上清液，重復(fù)操作5～6次，測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，并測定其多糖含量，根據(jù)式（1）和式（2）計算多糖保留率和蛋白質(zhì)的脫除率。

1.2.3.2 聚酰胺吸附柱層析法 將100 g聚酰胺于沸水中處理1 h，用蒸餾水洗去漂浮顆粒，冷卻至室溫裝柱，用蒸餾水洗脫24 h備用。配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的粗多糖溶液,以蒸餾水作洗脫劑。檢測洗脫液中蛋白質(zhì)的含量，并根據(jù)苯酚-硫酸法測定洗脫液中多糖含量，根據(jù)式（1）和式（2）計算多糖保留率和蛋白質(zhì)的脫除率。

1.2.3.3 大孔樹脂吸附柱層析法 將大孔樹脂D101、S-8分別于質(zhì)量濃度為5%的HCl中浸泡6～8 h,用蒸餾水洗至中性，然后于質(zhì)量濃度為5%的NaOH中浸泡6～8 h,用蒸餾水洗至中性，裝柱并用蒸餾水沖洗24 h備用。配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的粗多糖溶液,以蒸餾水作洗脫劑。采用1.2.1方法檢測洗脫液中蛋白質(zhì)的含量，并根據(jù)苯酚-硫酸法測定洗脫液中多糖含量，根據(jù)式（1）和（2）式計算多糖保留率和蛋白質(zhì)的脫除率。

式中：脫蛋白前多糖含量為A1；脫蛋白后多糖含量為A2；脫蛋白前蛋白的含量為B1；脫蛋白后蛋白的含量為B2。

1.2.4 粗多糖脫色劑篩選 樺褐孔菌粗多糖提取液顏色偏深，色素的存在影響多糖活性的測定，所以多糖脫色素為多糖生理活性研究奠定基礎(chǔ)。多糖中常采用的脫色方法有吸附法、化學(xué)法、離子交換法等[22?23]。本研究采用吸附劑脫色法進行脫色實驗，比較粉末活性炭、顆粒活性炭、大孔樹脂D101、S-8、聚酰胺五種脫色劑的脫色效果。

1.2.4.1 活性炭脫色法 分別稱取IOP100 mg溶于100 mL的蒸餾水中，配成多糖溶液。將配好的多糖溶液分別添加到粉末活性炭、顆粒活性炭中進行吸附，將多糖和活性炭混合液置于磁力攪拌器攪拌12～14 h，4000 r/min離心15 min保留上清液，于359 nm測定上清液的吸光度，根據(jù)式（3）計算脫色率，苯酚-硫酸法檢測多糖，根據(jù)式（1）計算多糖保留率。

1.2.4.2 大孔樹脂層析柱脫色法 分別稱取IOP 100 mg溶于100 mL的蒸餾水中，配成多糖溶液。將配好的多糖溶液分別加到預(yù)處理后的大孔樹脂D101、S-8中進行吸附，收集洗脫液，于359 nm測定上清液的吸光度，根據(jù)式（3）計算脫色率，苯酚-硫酸法檢測多糖，根據(jù)式（1）計算多糖保留率。

1.2.4.3 聚酰胺吸附柱層析法脫色素 稱取IOP 100 mg溶于100 mL的蒸餾水中，配成多糖溶液液。將配好的多糖溶液分別加到預(yù)處理后的聚酰胺吸附柱中進行層析，以蒸餾水作為沖洗劑，流速為2.0 mL/min。于359 nm測定收集液的吸光度，根據(jù)式（3）計算脫色率，苯酚-硫酸法檢測多糖含量，根據(jù)式（1）計算多糖保留率。

式中：脫色前的吸光度為C1，脫色后的吸光度為C2。

1.2.5 紫外-可見光譜分析 將質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的粗多糖溶液（經(jīng)過聚酰胺吸附柱處理），在190～400 nm的波長范圍內(nèi)進行掃描，驗證聚酰胺對IOP中蛋白質(zhì)的脫除效果。

1.2.6 DEAE-52纖維素柱分離純化 DEAE-52纖維素是具有親水性的陰離子交換劑。準確稱取DEAE-52纖維素樹脂100 g，在蒸餾水中浸泡24 h，用蒸餾水反復(fù)洗涂，去除蒸餾水中的懸浮顆粒，抽干，用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡30 min，攪拌后，用蒸餾水漂洗至中性；再用0.5 mol/L鹽酸溶液浸泡30 min，攪拌后，用蒸餾水漂洗至中性；最后用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡30 min，攪拌后，用蒸餾水漂洗至中性，抽干，備用。

將處理好的DEAE-52纖維素樹脂加適量蒸餾水，并攪拌，沿玻璃棒小心緩慢的灌入層析柱，同時敲擊柱壁，使填料沉降均勻、致密，隨后放置靜態(tài)沉降24 h，使層析柱達到平衡。

將經(jīng)過聚酰胺層析柱純化過的粗多糖配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，過0.45 μm濾膜，分別以蒸餾水、1.0、2.0、4.0 mol/L的NaCl進行梯度洗脫。流速為2.0 mL/min，每個梯度的洗脫液收集100管。根據(jù)苯酚-硫酸法隔管測定洗脫液中多糖含量，并以管數(shù)為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線。

1.2.7 DPPH自由基清除活性 參考徐妍等[24]的測定方式并作修改。配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的多糖溶液和維生素C溶液。在具塞試管中加入2 mL不同濃度的待測溶液，0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL。室溫，避光反應(yīng)30 min，517 nm波長下測定吸光值，記吸光值為As。以2 mL蒸餾水代替樣品溶液按照相同方法測定吸光值，是為Ao。以2 mL無水乙醇代替DPPH溶液，重復(fù)上述步驟測定吸光值，記為Ac。按公式：DPPH自由基清除率(%)=[1?(As?Ac)/Ao]×100，計算多糖樣品對DPPH自由基的清除率。

1.2.8 Sephade G-100層析柱純化 準確稱取葡聚糖凝膠Sephade G-100樹脂20 g，沸水浴加熱使其充分溶脹，用蒸餾水充分沖洗，去除懸浮顆粒，將沖洗后的葡聚糖凝膠Sephade G-100樹脂沿玻璃棒小心緩慢的灌入層析柱，隨后以流速為3 mL/min的蒸餾水平衡柱子。將經(jīng)過1.2.6純化后的樣品配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，過0.45 μm濾膜，以蒸餾水作為洗脫劑，每5 min收集一管。根據(jù)苯酚-硫酸法隔管測定洗脫液中多糖含量，并以管數(shù)為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線。

1.2.9 純度鑒定和相對分子質(zhì)量分布 多糖的純度可以根據(jù)色譜圖上出峰的數(shù)目和形狀進行判斷。所以采用高效液相色譜（HPLC）對多糖樣品進行純度鑒定。將相對分子質(zhì)量為6100、26290、84000、158000和291000的標準Dextran相繼進樣，利用GPC再解析軟件分析繪制的測定分子量大小的標準曲線。由此得出線性方程為：Y=?0.040X3+0.907X2+6.960X+23.21，R2=0.9985。

色譜柱：Waters UllrallydrogelTMLinear（φ7.8 mm×300 mm）;檢測器：Waters2410型示差折光檢測器；泵：Waters1525型泵；進樣器：Waters717型自動進樣器；流動相：純凈水；流速：1.0 mL/min；柱溫：55 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果取三次平行實驗的平均值，數(shù)據(jù)表示為 Mean±SD，采用OriginPro 8.6軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌的化學(xué)組成

表1為樺褐孔菌的化學(xué)組成分析，分析了樺褐孔菌中多糖、還原糖、蛋白質(zhì)、灰分的含量，蛋白質(zhì)含量為2.70%±0.17%，含量較低，多糖含量為13.10%±0.31%，粗多糖得率為9.40%±0.13%，表明樺褐孔菌中多糖含量豐富。

表1 樺褐孔菌的化學(xué)組成（%，W/W）Table 1 Chemical compositions of Inonotus obliquus (%,W/W)

2.2 粗多糖脫蛋白方法篩選

圖1為Sevage法、聚酰胺吸附柱層析法、大孔樹脂D101、S-8吸附柱層析法對IOP脫蛋白的效果圖。由圖1可知，Sevage法脫除效果較差，且多糖的損失大，而聚酸胺、大孔樹脂D101、S-8吸附柱層析法，脫除蛋白效果較好，脫除率達93.1%、88.8%、94.3%，且多糖損失少，保留率達到90.3%、71.2%、84.6%。綜合蛋白脫除率、多糖保留率的影響，選擇聚酰胺吸附柱層析法為最佳的脫蛋白法。

2.3 粗多糖脫色劑的篩選

圖2為粉末活性炭、顆粒活性炭、聚酰胺吸附柱層析法、大孔樹脂D101、S-8吸附柱層析法對IOP進行脫色的效果圖。由圖2可知，活性炭法脫除色素效果較差，且多糖的損失大，而大孔樹脂D101、S-8、聚酰胺吸附柱層析法脫色效果較好，脫除率達61.4%、76.2%、75.8%，且多糖損失少，保留率達到71.8%、84.6%、90.3%。綜合脫色率、多糖保留率的影響，選擇聚酰胺吸附柱層析法為最佳的脫色素方法。通過以上實驗可知，聚酰胺吸附柱層析法可以同時脫除樺褐孔菌多糖中的色素和蛋白質(zhì)，且多糖損失較少。此法可有效縮短樺褐孔菌多糖純化的工藝流程。

2.4 紫外-可見光譜分析

圖3為IOP在190～400 nm范圍內(nèi)的紫外-可見全光譜掃描。由圖3所示，經(jīng)過聚酰胺吸附柱層析法處理過的樺褐孔菌多糖在260、280 nm處未出現(xiàn)特殊吸收峰，說明樺褐孔菌多糖幾乎不含核酸和蛋白質(zhì)。

圖3 IOP的紫外-可見全光譜掃描Fig.3 UV-visible full spectrum scan of IOP

2.5 DEAE-52纖維素柱分離純化

粗多糖通過聚酰胺層析柱清除蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)后，要想獲得純度較高的多糖組分，需要對多糖進行下一步的分級純化。選用DEAE-52纖維素柱對初步純化后的樺褐孔菌粗多糖進行分離純化， 圖4為IOP在DEAE-52纖維素柱上的洗脫曲線圖。由圖4可知，利用DEAE-52纖維素柱對IOP進行分離純化，分別用不同濃度的NaCl進行洗脫，得到四個洗脫組分，并命名為IOP-1、IOP-2、IOP-3、IOP-4。

圖4 IOP在DEAE-52纖維素柱上的洗脫曲線Fig.4 Elution curve of IOP on DEAE-52 cellulose column

2.6 DPPH自由基清除效果

DPPH自由基清除能力是檢測真菌多糖抗氧化活性的一種重要指標[25]，圖5為樺褐孔菌粗多糖（IOP）及其分離純化產(chǎn)物IOP-1、IOP-2、IOP-3、IOP-4對DPPH自由基的清除能力。由圖5可知，各多糖組分對DPPH自由基清除率均隨著多糖濃度的增加而增大。在同一濃度下，對DPPH自由基的清除率大小情況為IOP>IOP-2>IOP-1>IOP-4>IOP-3，所以選取樺褐孔菌多糖組分IOP-2為研究產(chǎn)物進行后續(xù)探索。

圖5 樺褐孔菌多糖不同組分清除DPPH自由基能力Fig.5 Scavenging ability of DPPH free radicals by different components of IOP

2.7 Sephade G-100層析柱純化

葡聚糖層析是按分子量大小分離物質(zhì)的一種方法，此法被廣泛應(yīng)用于多種活性物質(zhì)的分離純化及產(chǎn)品制備中。利用Sephade G-100層析柱對IOP-2進行進一步的分離純化，IOP-2組分的洗脫曲線如圖6所示。由圖6可以看出，IOP-2在Sephade G-100層析柱上的洗脫可得兩個組分，分別命名為IOP-2a、IOP-2b。

圖6 IOP-2在Sephade G-100層析柱上的洗脫曲線Fig.6 Elution curve of IOP-2 on Sephade G-100 column

圖7 IOP-2不同組分清除DPPH自由基能力Fig.7 Scavenging ability of DPPH free radicals by different components of IOP-2

2.8 IOP-2經(jīng)Sephade G-100層析柱分離各組分對DPPH自由基的清除率

圖7 為IOP-2經(jīng)Sephade G-100層析柱分離純化后組分IOP-2a、IOP-2b對DPPH自由基的清除率，由圖7可知，IOP-2a、IOP-2b對DPPH自由基的清除率與多糖濃度成正比，且在同一多糖濃度下，IOP-2a對DPPH自由基的清除率明顯高于IOP-2b，IOP-2a對DPPH自由基的清除率要高于IOP-2b、IOP-2，原因可能是IOP-2a、IOP-2b未分離時相互作用，對DPPH自由基的清除起抑制作用，或者IOP-2中含有其他物質(zhì)影響其對DPPH自由基的清除率，所以選取樺褐孔菌多糖組分IOP-2a為研究產(chǎn)物進行后續(xù)探索。

2.9 純度鑒定和相對分子質(zhì)量分布

圖8為IOP-2a的高效液相色譜圖，由圖8可知，IOP-2a經(jīng)過高效液相色譜柱后只檢測出一個峰，峰形對稱且陡峭，說明IOP-2a為均一性多糖組分。由表2可知，IOP-2a的相對分子質(zhì)量為72461 Da。

圖8 IOP-2a高效液相色譜圖Fig.8 High performance liquid chromatography of IOP-2a

表2 IOP-2a的相對分子質(zhì)量分布Table 2 Relative molecular mass distribution of IOP-2a

3 結(jié)論

本文以樺褐孔菌為原料，研究了樺褐孔菌子實體的化學(xué)成分組成：多糖13.10%±0.31%、還原糖4.21%±0.40%、蛋白質(zhì)2.70%±0.71%、灰分9.60%±0.31%。采用水提醇沉的方法提取樺褐孔菌粗多糖，對樺褐孔菌粗多糖脫蛋白、脫色素的試驗方法進行挑選，得到聚酰胺層析法為最佳的脫除方法。蛋白質(zhì)的脫除率為93.1%、脫色率為75.8%，多糖的保留率為90.3%。IOP經(jīng)過DEAE-52纖維素柱層析后得到四個單糖組分：IOP-1、IOP-2、IOP-3、IOP-4。對四個多糖組分進行抗氧化實驗發(fā)現(xiàn)，IOP-2對DPPH自由基的清除率最高。IOP-2經(jīng)過Sephadex-100層析柱后獲得兩個多糖組分：IOP-2a、IOP-2b。對比其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)IOP-2a的活性較高。采用高效液相色譜法鑒定多糖組分IOP-2a，只檢查出一個對稱峰，說明IOP-2a為均一性多糖。

本研究以DEAE-52纖維素柱、Sephade G-100層析柱分離純化樺褐孔菌粗多糖，最后獲得分布均一、高純度的多糖組分IOP-2a，為樺褐孔菌多糖組分的結(jié)構(gòu)研究及其活性研究提供技術(shù)支持。