珠芽魔芋組培快繁技術

魏博 潘登浪 劉子凡 曾憲海 李煒芳

摘 ?要：為探索出一套適于珠芽魔芋的組培快繁技術體系，本研究以珠芽黃魔芋不同發育時期的葉片為外植體，開展組培快繁技術研究。結果表明：以開始伸出鱗片葉片作為外植體材料，75%酒精消毒30?s后，0.1% HgCl₂溶液中浸泡15?min為宜，其成活率達到96.7%;最優愈傷組織誘導培養基配方為MS+TDZ 0.5?mg/L+NAA 0.1?mg/L+蔗糖30.0?g/L+瓊脂6.0?g/L，其誘導率達到95.6%;最優不定芽誘導培養基配方為MS+6-BA 1.0?mg/L+NAA 0.5?mg/L+蔗糖30.0?g/L+瓊脂6.0?g/L，不定芽誘導率達到71.1%，單位接種質量愈傷組織分化芽數達到2.88;全展葉片苗在MS+NAA 0.25?mg/L+蔗糖15.0?g/L+瓊脂?6.0?g/L培養基的生根率達到100.0%，平均根數達到1.36。以開始伸出鱗片葉片為外植體建立的珠芽黃魔芋組培快繁技術體系，達到了魔芋種苗的規?；a技術水平，對解決珠芽魔芋產業發展中種芋供不應求的問題具有積極意義。

關鍵詞：珠芽魔芋;組織培養;快速繁殖;耐蔭植物中圖分類號：S632.3??????文獻標識碼：A

Tissue Culture and Plant Regeneration of Amorphophallus bulbifer

WEI Bo^1，2， PAN Denglang^2*， LIU Zifan^1*， ZENG Xianhai²， LI Weifang²

1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Danzhou Investigation and?Experiment Station of Tropical Crops， Ministry of Agriculture and?Rural Affairs， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract： In order to explore the tissue culture and rapid propagation ofAmorphophallus bulbifer，?the leaves of different growth period ofA. bulbiferwere used as explants.The best surface sterilization was achieved by immersing the explants in the solution of 75% alcohol for 30 seconds then in 0.1% HgCl₂solution for 15 minutes and the survival rate reached 96.7%.?The best callus induction medium was MS+TDZ 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+sugar 30.0 g/L+agar 6.0 g/L and the callus induction rate reached 95.6%. The best bud induction medium was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+sugar 30.0 g/L+?agar 6.0 g/L on which?the bud induction rate and number of differentiation buds of callus with unit inoculation quality reached 71.1% and 2.88.?The best medium for rooting was MS+NAA 0.25 mg/L+sugar 15.0 g/L+agar 6.0 g/L， on which the rooting rate reached 100.0% and the average root number reached 1.36. Tissue culture and rapid propagation technology system ofA. bulbifer was established by extruding scale leaves as explants，which?reached the scale production technology level of konjac seedlings and is of positive significance to solve the problem of shortage of seed taro in the development of konjac industry.

Keywords： Amorphophallus bulbifer;?tissue culture; rapid propagation; shade plant

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.010

魔芋又名蒟蒻、鬼芋、花梗蓮、藥翦等，屬天南星科（Araceae）魔芋屬（AmorphophallusBlume）多年生單子葉植物^[1]，是植物界內目前發現唯一能夠在其發達的地下球莖中合成大量葡甘聚糖的草本植物，葡甘聚糖是地下球莖的主要成分，含量高達50%以上，具有降脂降血糖^[2-3]、利便^[4]以及預防高血壓和血栓^[5]等功效，并且由其地下球莖制成的魔芋粉具有較好的穩定性、持水性、凝膠性、復配性以及高黏性，被廣泛應用于環保、食品、醫藥、保健、農業、日化及建筑等領域^[6-7]，具有很高的開發利用價值。魔芋在我國已經有2000多年的栽培歷史^[8]，其中花魔芋（Amorphophallusrivieri Durieu）是栽培比較廣泛的品種^[9]，但其繁殖系數低、生長周期長且規?；N植病害嚴重^[10-12]，尤其不適于在熱帶高溫高濕多雨生態區種植，嚴重制約著我國魔芋產業的發展。

珠芽魔芋[Amorphophallus bulbifer（Roxb.） Blume]起源于東南亞熱帶雨林地區^[11]，是一類可以在植株主莖與分枝、分枝與分枝、分枝與裂葉、裂葉與裂葉交叉點上生長出氣生珠芽球莖的魔芋種，主要分布在中國云南、老撾、緬甸、泰國、印度、孟加拉國以及馬來西亞等地^[13]。珠芽魔芋植株高1.6～1.8?m，喜高溫高濕的環境，但懼強光直射，在遮蔭度75%的環境下可以達到最佳產量^[14]，將其套種在3年生橡膠樹下的光合速率和產量最高，且魔芋也可以極大地促進橡膠樹的生長^[15]，不僅可以緩解林下土地資源閑置等問題，還可以穩固橡膠在國家可持續發展戰略資源的地位。珠芽魔芋具有葡甘聚糖含量高、生長周期短、生育期長及抗病能力強等優良特性，是魔芋屬中適宜于熱帶、亞熱帶低海拔地區高溫高濕環境的半陰性經濟作物，具有良好的產業開發與市場前景。但目前在珠芽魔芋栽培中存在用種量較大的問題，生產中多采用繁育葉面球莖或地下球莖切塊的繁殖方式，遠不能滿足與日俱增的種苗需求，并且種芋品系不純，

內在品質存在明顯差異，組培快繁技術對解決珠芽魔芋產業發展中種芋純化及種芋供不應求的問題具有積極意義。雖然關于魔芋的組織培養技術已有諸多報道^[16-21]，但是關于珠芽魔芋組培研究的報道較少，吳金平等^[22]采用珠芽魔芋葉鞘為外植體建立了組培技術體系，但未報道愈傷組織、不定芽誘導率等技術參數。胡楠^[23]以珠芽魔芋2年生球莖為外植體，探索了植物生長調節劑配比和培養基狀態對外植體褐化和愈傷組織誘導、不定芽誘導、生根誘導的影響，發現在所試激素配比下淺層液體培養基對防止外植體褐化和愈傷組織誘導、不定芽誘導、生根誘導均優于固體培養基，其研究結果還顯示用球莖做外植體褐化率較高。桂明春等^[24]以珠芽魔芋試管苗葉柄為外植體，探索了植物生長調節劑對珠芽魔芋組織培養各環節的影響。珠芽魔芋外植體的選擇主要是球莖和葉柄，且珠芽類魔芋種質較多，不同外植體材料及種質使用的最佳植物生長調節劑組合差異顯著，目前關于以珠芽魔芋不同發育時期的葉片為外植體建立組培快繁體系的研究鮮見報道。因此，本研究以從云南省景洪市獲得的珠芽黃魔芋不同發育時期的葉片為外植體，開展組培快繁研究，以探索出一套適于珠芽黃魔芋的組培快繁技術體系，解決熱區魔芋產業發展面臨的健康優良種芋供應不足等問題，以期為加快熱區魔芋產業發展提供技術支持。

1??材料與方法

1.1材料

2018年從云南省景洪市獲得珠芽黃魔芋（Amorphphallus bulbifer）葉面球莖，種植于海南省海口市中國熱帶農業科學院橡膠研究所實驗室的盆栽試驗區內，根據實驗需要分別采集不同發育時期的葉片作為外植體材料開展組培實驗，包括葉芽、開始伸出鱗片葉片、完全伸出鱗片葉片、剛展開的葉片和成熟的葉片（圖1）。

1.2方法

1.2.1??外植體消毒??采集珠芽黃魔芋開始伸出鱗片的葉片作為外植體材料，將材料清洗干凈后，放置在干凈的燒杯中并蓋上一層紗布（用橡皮筋固定），然后用自來水沖洗1?h后，最后在超凈工作臺上按無菌操作要求對外植體材料進行消毒處理。實驗共設計4個消毒處理，即0.1% HgCl₂溶液浸泡5、10、15、20?min，每處理3個重復，每處理60段材料。無菌操作步驟如下：（1）用75%酒精消毒30?s，然后用無菌水沖洗數次;（2）用0.1% HgCl₂溶液分別浸泡5、10、15、20?min，再用無菌水沖洗5次，最后用無菌濾紙吸干水分;（3）將材料切成小段，每段長約0.5?cm，然后接種于MS+6-BA 1.0?mg/L+NAA 0.1?mg/L+蔗糖30?g/L+瓊脂7?g/L的培養基（pH?6.0）中;（4）接種后于25?℃條件下暗培養2周，再轉移到25?℃，光照1000～1500?lx下培養，每天光照12?h，30?d后統計外植體的污染率、褐化率及成活率。

1.2.2 ?外植體材料篩選???選取5種不同發育時期葉片作為外植體材料，即葉芽、開始伸出鱗片葉片、剛完全伸出鱗片葉片、剛展開的葉片、成熟的葉片，參照1.2.1中的外植體消毒（0.1% HgCl₂溶液浸泡15?min）、接種、暗培養和光培養方法進行處理，30?d后統計外植體的污染率、褐化率、愈傷組織誘導率及死亡率。

1.2.3 ?愈傷組織誘導??愈傷組織誘導培養基設TDZ和NAA?2個因子，TDZ設置3個水平，分別為0.1、0.5、1.0?mg/L;NAA設置3個水平，分別為0.1、0.5、1.0?mg/L，隨機區組設計，3個重復。培養基中添加蔗糖30?g/L，瓊脂6?g/L，pH調至6.0。實驗采用開始伸出鱗片的葉片為外植體材料，參照1.2.1中的外植體消毒方法（0.1% HgCl₂溶液浸泡15?min）進行消毒并接種至愈傷組織誘導培養基上，每個處理接種45段，然后參照1.2.1中的暗培養和光培養方法進行培養，30?d后統計愈傷組織誘導率。

1.2.4 ?不定芽誘導??不定芽誘導培養基設6-BA和NAA?2個因子，6-BA設置3個水平，分別為0.1、0.5、1.0?mg/L;NAA設置3個水平，分別為0.1、0.3、0.5?mg/L，隨機區組設計，3個重復。培養基中添加蔗糖30?g/L，瓊脂6?g/L，pH調至6.0。選取接種質量約為5?g的愈傷組織小塊，接種至不定芽誘導培養基上，每個處理接種45塊，然后置于28?℃、光照2000?lx下培養，每天光照12?h，培養45?d后統計各處理的不定芽誘導率及單位質量愈傷組織分化芽數。

1.2.5 ?生根誘導??設4個因素，分別為NAA、不同狀態的組培苗、基本培養基和蔗糖濃度。其中NAA濃度設4個水平，分別為0.00、0.10、0.25、0.50?mg/L;組培苗狀態設2個水平，3?cm長的芽和全展葉片苗;基本培養基設2個水平，1/2 MS和MS;蔗糖濃度設2個水平，15、30?g/L;添加瓊脂6?g/L，pH調至5.8。采用L₈（4×2⁴）正交試驗設計，每處理3個重復，每處理接種45株。將叢芽分切成單芽，接種于生根培養基，然后置于28?℃、光照1000?lx下培養，每天光照12?h，4周后統計各處理生根株數及長于2?cm根數。

1.3計算公式

污染率=污染外植體塊數/接種總塊數×100%

褐化率=褐化外植體塊數/接種總塊數×100%

成活率=成活外植體塊數/接種總塊數×100%

死亡率=死亡外植體塊數/接種總塊數×100%

愈傷組織誘導率=長愈傷組織外植體塊數/接種總塊數×100%

不定芽誘導率=萌芽的外植體塊數/接種總塊數×100%

單位接種質量愈傷組織分化芽數=N/（W₂–W₁）

式中，N：芽長大于2 cm個數;W₁：培養基+?瓶子;W₂：培養基+瓶子+培養物。

生根率=生根株數/接種單苗總株數×100%

平均根數=長于2?cm根數/接種單苗總株數

1.4數據處理

采用Excel 2016和DPS 7.5軟件進行統計分析，多重比較采用鄧肯氏新復極差檢驗法（Duncans multiple ranger test）。

2??結果與分析

2.1不同消毒時間對開始伸出鱗片葉片外植體消毒效果的影響

從表1可知，0.1% HgCl₂的消毒時間對開始伸出鱗片葉片外植體消毒效果具有顯著性的影響。消毒時間低于15?min，隨著時間的延長，污染率降低，消毒時間為5?min和10?min時污染率分別為36.7%和23.3%，污染率較高，觀察到的污染均是細菌性污染，而消毒時間為15?min和20?min時污染率均為0，所以消毒時間過短不能完全殺死細菌。但是隨著消毒時間的延長，褐化率也逐漸升高，消毒時間為15?min和20?min時褐化率分別達到3.3%和8.3%。通過綜合評價，最佳消毒方式為使用0.1% HgCl₂消毒15?min，其污染率為0，褐化率3.3%，成活率達到96.7%。

2.2不同發育時期外植體材料對愈傷組織誘導的影響

不同發育時期的外植體對愈傷組織誘導效果存在差異（表2）。葉芽的污染率和褐化率較高，分別達到16.7%和56.7%，可能原因是葉芽較幼嫩，消毒劑對其自身傷害較大，且卷曲多縫，消毒劑難以到達部分區域，導致消毒不夠徹底。剛展開的葉片和成熟的葉片外植體材料生長緩慢，葉片邊緣黃化，最終全部死亡。開始伸出鱗片葉片與剛完全伸出鱗片葉片的污染率、褐化率、死亡率均差異不顯著，并且愈傷組織誘導率分別達到96.7%和93.3%。通過綜合評價，最佳的外植體材料為開始伸出鱗片葉片。

2.3不同植物生長調節劑對愈傷組織誘導的影響

不同植物生長調節劑對愈傷組織誘導效果存在差異（表3）。當TDZ濃度一定時，隨著NAA濃度的增大，愈傷組織誘導率逐漸下降，在TDZ濃度為0.1?mg/L與NAA濃度為1.0?mg/L時，愈傷組織誘導率最低，僅為26.7%;而當NAA一定時，隨著TDZ濃度的增大，愈傷組織誘導率先升高后下降，在NAA濃度為0.1?mg/L與TDZ濃度為0.5?mg/L時，愈傷組織誘導率達到最高。這表明在愈傷組織誘導過程中，TDZ起主導作用，而低濃度NAA有利于愈傷組織的誘導。通過綜合評價，愈傷組織誘導最佳植物生長調節劑配比為：TDZ濃度為0.5?mg/L，NAA濃度為0.1?mg/L，此時愈傷組織誘導率達到95.6%（圖2A）。

2.4不同植物生長調節劑對不定芽誘導的影響

不同植物生長調節劑對不定芽誘導率的影響不顯著，而對單位接種質量愈傷組織分化芽數的影響存在顯著差異（表4）。隨著6-BA濃度的增大，單位接種質量愈傷組織分化芽數增大，當6-BA濃度為0.1、0.5?mg/L時，隨著NAA濃度的增大，單位接種質量愈傷組織分化芽數降低，當6-BA濃度為1?mg/L時，隨著NAA濃度的增大，單位接種質量愈傷組織分化芽數增大。通過綜合評價，不定芽誘導最佳植物生長調節劑配比為：6-BA濃度為1?mg/L，NAA濃度為0.5?mg/L，此時單位接種質量愈傷組織分化芽數達到2.88個/g（圖2B）。

2.5不同培養基成分對生根誘導的影響

將叢芽分切成單芽，接種于生根培養基，在各處理間生根率差異較大（表5），其中處理6的生根率最高（圖2C），達到100.0%，處理7的生根率最低，僅為44.5%。通過比較F值發現，對生根誘導影響大小依次為：組培苗不同狀態>?NAA>蔗糖濃度>基本培養基。

由表5可見，當NAA濃度在0～0.25?mg/L范圍內增大時，全展葉片苗的生根率逐漸升高，在

NAA濃度達到0.25?mg/L時，生根率達到100.0%。當NAA濃度在0.1～0.5?mg/L范圍內增大時，全展葉片苗的平均每株生根數逐漸下降，但是長出的根會更加粗壯。綜合考慮下，全展葉片苗在MS+NAA 0.25?mg/L+蔗糖15?g/L+瓊脂6.0?g/L培養基中最適合生根誘導。

2.6馴化移栽

將經生根培養獲得的具根、莖、葉組培苗（根長2～8 cm，苗高3～5 cm）移到室溫、自然光下閉口放置4 d，移出苗并洗凈粘附于植株基部的培養基，移栽于裝有基質的10×7穴盤中，基質成分比為表土∶泥炭∶有機肥=1∶2∶1，移栽基質用

50%多菌靈1000倍+70%農用鏈霉素200?mg/L進行消毒。移栽后前3?d早晚覆蓋薄膜，4～15?d白天蓋薄膜，晚上揭開薄膜，整個過程控制濕度在90%以上，并遮蓋2層遮陽網，移栽15?d后，可揭開薄膜進行苗圃常規管護^[22]。移栽30?d后，移栽成活率為97%（圖2D）。

3??討論

影響愈傷組織誘導的因素一般包括消毒方式、外植體的類型以及培養基的類型等。其中，消毒時間是獲得無菌培養材料的重要因素，在本研究中發現隨著0.1% HgCl₂消毒時間的增加，污染率逐漸下降，褐化率逐漸升高，而成活率先升高再下降，這表明消毒劑消毒時間過長也會對外植體本身造成傷害，這與李新等^[25]對山蔞嫩莖消毒的研究結果一致。不同部位的外植體以及外植體的新老程度都會對愈傷組織的誘導有極大影響。目前關于魔芋組培外植體的選取研究中，使用芽、芽鞘^[26]、葉片^[27]、葉柄^[28]、球莖^[29]、種子^[30]作為外植體材料并成功誘導出完整植株的研究皆有報道，而在珠芽魔芋組培快繁研究中，主要以球莖和葉柄作為外植體材料^[23-24]，而對不同發育時期的葉片作為外植體的研究未見報道。本研究采用珠芽黃魔芋不同發育時期的葉片作為外植體時發現，開始伸出鱗片至剛完全伸出鱗片的葉片的污染率、褐化率、死亡率均最低，而愈傷組織誘導最高，可能是該葉片發育時期的外植體生長最活躍，帶菌少，細胞含酚類化合物較少，生理狀態處于最適誘導愈傷組織時期;葉芽的污染率和褐化率較高，可能是因為頂芽生長在高溫高濕的土壤中，不可避免地攜帶了大量的外生菌和內生菌，而內生菌極難通過表面消毒殺死，所以造成外植體污染率極高，這與劉進平^[31]對胡椒組培過程中污染問題的研究結果一致;本研究中葉芽褐化率和死亡率較高，可能是因為葉芽期材料幼嫩，消毒劑對其傷害比較重。剛展開的葉片和成熟的葉片在愈傷組織誘導過程中發現，其生長速度緩慢，葉片邊緣黃化，最終全部死亡，這與秦正偉等^[27]采用全展開時期葉片作為外植體材料的研究結果一致。王自布等^[7]以魔芋幼葉、塊莖、莖段為外植體誘導愈傷組織過程中，發現在培養基中加入2，4-D或者IAA后，幼葉和莖段的愈傷組織誘導率大于塊莖。張征蘭等^[26]在魔芋組織培養與植株再生的研究中發現，在MS培養基中只加入細胞分裂素或生長素均不能誘導出愈傷組織，只有同時加入細胞分裂素與生長素才能成功誘導出愈傷組織。本研究采用剛伸出鱗片葉片作為外植體材料，發現不同植物生長調節劑對愈傷組織誘導效果差異顯著，當TDZ濃度為0.1?mg/L與NAA濃度為1.0?mg/L時，愈傷組織誘導率最低，僅為26.7%，而當NAA濃度一定時，隨著TDZ濃度的增大，愈傷組織誘導率先升高后下降，在NAA濃度為0.5?mg/L與TDZ濃度為0.1?mg/L時，愈傷組織誘導率達到最高，這表明在愈傷組織誘導過程中，細胞分裂素起主導作用，而低濃度的生長素有利于愈傷組織的形成，這與莊承紀等^[28]對魔芋屬植物愈傷組織誘導的研究結果一致。

植物生長調節劑是通過改變植物內源激素的平衡起作用，而內源激素的平衡影響植物器官的分化^[32]，所以不同植物生長調節劑種類和濃度對不定芽的誘導具有重要作用。胡悅等^[33]對魔芋組培快繁的影響因素研究結果表明，不同細胞分裂素種類及濃度對花魔芋腋芽的誘導具有顯著差異，細胞分裂素濃度過低或過高都不利于腋芽的形成。段龍飛等^[34]在花魔芋實生種子組織培養研究中發現，低濃度的生長素與適宜濃度的細胞分裂素有利于不定芽的分化。本研究中，隨著細胞分裂素的增加，不定芽誘導率沒有顯著差異，但單位愈傷組織分化芽數逐漸增大，最高達到2.88個/g，可能原因是設置的細胞分裂素濃度范圍尚未達到不定芽分化最適濃度。

生長素可以有效促進組培苗生根^[35-36]，但濃度過高則會產生乙烯，從而產生抑制作用^[37]。趙青華等^[38]在對魔芋叢生芽生根的誘導過程中，添加了多效唑，可以與生長素起協同作用，使組培苗生根更快。本研究采用正交試驗設計，探明了不同狀態組培苗與培養基成分對組培苗生根的影響情況，通過比較F值發現，對生根誘導影響大小依次為：組培苗不同狀態>NAA>蔗糖濃度>基本培養基。原因可能是因為全展葉片組培苗能夠進行光合作用產生更多的生長素，更有利于促進組培苗的生根，而NAA對組培苗生根的影響僅次于組培苗不同狀態，當NAA濃度在0～0.25?mg/L范圍內增大時，全展葉片苗的生根率逐漸升高，在NAA濃度達到0.25?mg/L時，生根率達到100.0%，這與蔣曉云等^[39]在研究紅魔芋塊莖生根誘導試驗中的結果相似，蔗糖濃度和基本培養基對組培苗生根的影響較小。

本研究初步建立了包括外植體消毒與篩選、愈傷組織誘導、不定芽誘導、生根誘導及馴化移栽的珠芽黃魔芋組培快繁技術體系，為魔芋種苗的規?；a提供了技術支撐，對解決珠芽魔芋產業發展中種芋供不應求的問題具有積極意義。

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責任編輯：崔麗虹