焙烤對綠豆蛋白結構和功能性質的影響

張 舒,盛亞男,馮玉超,富天昕,張藝瑋,姜穎俊,于 淼,王長遠,*

(1.黑龍江八一農墾大學食品科學學院,黑龍江大慶 163319; 2.國家雜糧工程技術研究中心,黑龍江大慶 163319)

綠豆屬于豆科植物(別稱青小豆、菉豆、植豆等),其營養價值和藥用價值較高,種子和莖被廣泛食用。綠豆中蛋白含量較高為22%～26%[1],具有很多生理功能,可以起到刺激神經系統,促進腸胃蠕動的作用[2]。綠豆蛋白的水解物還可以提高膽汁中膽鹽的分泌量,從而發揮降膽固醇的功效[3]。在不同加工方式下,蛋白質組分及其氨基酸構成會發生變化,影響其營養及功能性質[4-5]。熱處理會導致蛋白變性,降低豆類蛋白營養和功能的有效性[6]。王雅卉等[7]發現高溫加工不同于一般性加工,會引發酶解產物的聚合,改變蛋白的特性。熱處理通常會影響蛋白質的基本功能性質,如持油性、持水性、乳化及穩定性、溶解性和起泡及穩定性等[8]。夏珂等[9]發現熱處理過程中會導致自由氨基和羰基含量的改變,從而影響蛋白質的功能性質。

食品熱加工分為濕熱、干熱、微波加熱三種,除常見的濕熱加工的產物——綠豆湯,被人們認為是清熱解暑的“良藥”外,干熱加工的焙烤類食品如綠豆休閑豆、綠豆沖調粉以及五谷雜糧代餐粉等新興產品也越來越受到人們的喜愛。梁亞靜[10]發現在焙烤期間會因美拉德反應的發生,產生氨基酸脫羧、醛類等風味物質,但也會對蛋白質含量及功能性質造成一定的影響。為了更好的保持和調控綠豆焙烤類食品的營養特性,本研究通過在不同的焙烤強度下對綠豆進行熟制加工,研究綠豆蛋白的結構及功能性質,并找出功能性質相對較好的焙烤條件。有助于提高人們對熱加工改性后綠豆蛋白的認知,并為焙烤綠豆蛋白的結構以及功能性質研究提供理論參考,同時以期為綠豆焙烤類新興產品的加工生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆 山西明綠豆;鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、碳酸鈉、福林-酚試劑、SDS(十二烷基硫酸鈉)、牛血清白蛋白 國藥集團化學試劑有限公司;SDS-PAGE凝膠試劑盒 南京建成生物工程研究所;蛋白Marker(SM0431) 立陶宛Fermentas Life Sciences公司;考馬斯亮藍G250 天津市科密歐化學試劑廠。

TG16-WS離心機 長沙湘儀有限責任公司;烤箱 北京廚邦盛世廚房設備有限公司;DGG-9140電熱恒溫鼓風干燥箱、DL700超高壓等靜壓機 上海大隆機器廠;Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司;精密增力電動攪拌器,常州國華電器有限公司;MAGNA-IR560傅立葉變換紅外光譜系統 美國尼高力公司;DYY-8C型垂直電泳儀 北京市六一儀器廠;UV757CRT紫外可見分光光度計 上海分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠豆前處理 將綠豆除去不飽滿粒、發霉粒后,洗凈。稱取等份綠豆放入托盤中,鋪平,用烤箱分別在110、130、150、160、180、200 ℃六種溫度下烤至可食用狀態,具體時間為:110 ℃下焙烤70 min、130 ℃下焙烤50 min、150 ℃下焙烤30 min、160 ℃下焙烤25 min、180 ℃下焙烤20 min、200 ℃下焙烤15 min。待溫度降低至室溫,粉碎后過80目篩,冷凍備用。

1.2.2 綠豆蛋白的提取 將粉碎好的綠豆粉脫脂后晾干裝入封閉袋中待用。使用堿提酸沉法提取綠豆蛋白,參照喬寧等[11]的實驗方法:用1 mol/L NaOH溶液將混合后綠豆粉與蒸餾水(按1∶10比例混勻)的pH調節至10.0,在50 ℃水浴鍋中用電動攪拌槳攪拌2 h后離心20 min(條件為4000 r/min),取上層液體;將所取液體的pH調至4.6,靜置產生明顯分層后倒出上清液,將剩余部分離心20 min,將沉淀涂板,冷凍干燥后,于-80 ℃備用。

1.2.3 綠豆蛋白提取率的測定 采用福林酚法對提取液中的蛋白含量進行測定,綠豆蛋白提取率的計算公式[11-12]如下:

綠豆蛋白提取率(%)=提取液中蛋白含量/綠豆中蛋白含量×100

式(1)

1.2.4 SDS-PAGE測定 取0.5 mg/mL的蛋白溶液1 mL,加入1 mL樣品緩沖液(0.25 mol/L Tris-HCl,0.5%溴酚藍,10% SDS,50%甘油,5%β-疏基乙醇)混勻,-20 ℃儲存,沸水煮制3～5 min使蛋白充分變性。上層濃縮膠的質量分數和下層分離膠的質量分數分別為5%、12%,上樣體積為10 μL。起初電壓80 V恒壓,到分離膠電壓改為120 V,當條帶接近膠板下邊緣時停止電泳。并用考馬斯亮藍G250染色后進行洗脫[13]。

1.2.5 紅外光譜測定 稱取0.002 g干樣品與0.2 g溴化鉀,將二者混合研磨均勻后壓片測定FTIR。在4000～400 cm-1處測定吸收光譜,分辨率4 cm-1,波數精度0.01 cm-1,掃描次數64次,環境溫度25 ℃[14]。

1.2.6 溶解性的測定 以牛血清白蛋白繪制標準曲線,標準曲線方程為:y=0.2043x+0.0002(R2=0.9969)。測定綠豆蛋白在不同加工條件下的吸光度。磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中加入一定量的樣品,配置成5 mg/mL的蛋白溶液,攪拌30 min后靜置,離心[15]。分別將離心后的上清液1 mL,堿性銅溶液1 mL和福林-酚試液4 mL加入25 mL試管中,立即搖勻,置55 ℃的水浴條件下反應5 min,冷水浴反應10 min,并于650 nm波長處測定吸光度。按式(2)計算蛋白質的溶解度。

式(2)

1.2.7 持水性、持油性的測定 將蒸餾水與綠豆蛋白按照40∶1的比例在漩渦混合器中混勻后靜置20 min,將混合液離心30 min(條件為3000 r/min),測量上清液體積V1,蛋白的持水量為蒸餾水含量減去V1。持油性同上(綠豆蛋白與油的比例按照1∶20)[16]。

1.2.8 乳化性、乳化穩定性的測定 參考Wu等[17]實驗方法并進行適當調整,用pH=7.0濃度為0.1 mol/L的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液)配制蛋白質溶液,使其質量濃度為0.2%,取8 mL蛋白質溶液加入2 mL大豆油,在室溫下用均質機均質1 min(1000 r/min)。均質后立刻取漿液50 μL,取樣位置在離心管底部0.5 cm處,并倒入5 mL質量分數為0.1%的SDS溶液中,振蕩混勻后測吸光度(500 nm)記為A0。將上述方法混合液靜置10 min后在上述相同位置處取50 μL樣液,后續操作同上,測定吸光度記為Aφ。(以0.1%SDS溶液做空白對照)乳化性和乳化穩定性計算公式如下:

式(3)

式(4)

式中:c為蛋白質溶液濃度,g/mL;φ為油相體積分數,%

1.2.9 起泡性、起泡穩定性的測定 參考Agyare等[18]的方法,稍作改動:在質量濃度為1 g/100 mL的蛋白溶液中取100 mL,用均質機均質30 s,快速移至100 mL量筒中,記錄泡沫體積V0;30 ℃水浴鍋中靜置30 min后記錄泡沫體積V1。分別按式(5)、(6)計算起泡性和起泡穩定性。

式(5)

式(6)

式中:V0:泡沫所占的體積(mL);V1:泡沫的殘留體積(mL)。

1.3 數據處理

實驗均進行3次平行,數據處理采用Excel 2010、Origin軟件進行分析和作圖,采用SPSS Statistics 24.0軟件中的Duncan法進行數據顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 綠豆蛋白的提取率及純度

圖1為不同焙烤強度下綠豆蛋白的提取率及得率純度。焙烤加工后綠豆蛋白的提取率與未加工的綠豆蛋白相比顯著(P<0.05)降低。綠豆蛋白的純度為87.2%,加工后綠豆蛋白的純度均在86.3%～86.9%之間無顯著差異。

圖1 綠豆蛋白的提取率、純度Fig.1 Extraction rate and purity of mung bean protein

2.2 SDS-PAGE分析

由圖2可知泳道1～7為綠豆蛋白條帶,共有5個亞基條帶,分別為61.7、57.5、50.1、25.1和19.5 kDa。由于焙烤溫度不同,蛋白條帶和亞基條帶都會發生變化。隨著焙烤溫度的增加,各個范圍的條帶均變淺,Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ條帶幾乎消失,說明熱變性使得綠豆蛋白各亞基條帶發生不同程度的降解,使蛋白質內部結構被破壞,肽鏈斷裂,焙烤溫度越高則蛋白質分子降解現象越為嚴重,條帶越淺。在180 ℃時第Ⅲ條亞基帶顏色加深,可能是由于大分子蛋白降解為小分子蛋白后重新聚集所致,也可能在該溫度下與其他物質發生了結合導致亞基條帶加深。

圖2 綠豆蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of mung bean protein注:M:標準蛋白;泳道1:生蛋白;泳道2:110 ℃焙烤70 min;泳道3:130 ℃焙烤50 min;泳道4:150 ℃焙烤30 min;泳道5:160 ℃ 焙烤25 min;泳道6:180 ℃ 焙烤20 min;泳道7:200 ℃焙烤15 min;I～VI:不同處理溫度下綠豆蛋白的亞基條帶。

2.3 紅外光譜分析

各峰位歸屬指認依據如表1[19]。隨著焙烤強度的改變,蛋白質的二級結構也受到影響進行改變。通過對酰胺Ⅰ帶進行傅里葉去卷積光譜擬合分析得到表2,可以看出綠豆蛋白的主要結構為α-螺旋和β-折疊,而焙烤加工后β-折疊結構含量顯著增加,α-螺旋結構、β-轉角結構含量顯著降低,這與李朝陽等[20]的溫度對蛋白結構的影響結論一致。維持蛋白質二級結構穩定性大部分由氫鍵完成,當蛋白受熱開始變性時,則會破壞這些作用力,從而破壞蛋白質分子穩定性,導致蛋白質結構發生顯著變化。圖3的紅外光譜圖中1640 cm-1處的峰在110和180 ℃分別出現紅移,其他溫度下蛋白與生綠豆蛋白相比該峰值出現藍移,加工后蛋白在1243 cm-1處均出現紅移現象,表明加工后蛋白質的基團不穩定,與電泳圖一致。在150和180 ℃蛋白的譜圖中可以看出1050 cm-1波長處出現明顯的峰值,該處是醇、酚、胺的特征吸收峰。說明在該溫度下蛋白可能會與該類物質結合,或者由于美拉德反應而出現新的物質,這與電泳結果相呼應。

表1 各峰位歸屬指認依據Table1 The attribution basis of each peak position

表2 綠豆蛋白二級結構組成比例Table 2 Attribution basis of each peak position

圖3 綠豆蛋白紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of mung bean protein

2.4 溶解性分析

吸水后可溶性蛋白會分散成膠體即為溶解性,想要發揮功能特性則需要良好的蛋白溶解性[21]。由圖4可知,未進行加工綠豆蛋白溶解性較差約為27.31%,最高溶解性在焙烤溫度為180 ℃約為47.72%,相比之下進行熱加工后的綠豆蛋白顯著優于未進行熱加工(P<0.05)?？赡苁堑鞍踪|結構在合適的溫度下會展開,其中內部的極性基團和肽鍵裸露得越來越多,進而增強了蛋白質與水的相互作用,使溶解性提高。這和周偉等[22]對梨小豆蛋白溶解性的研究趨勢恰恰相反,出現這種形勢第一可能由于豆類不同蛋白質變性適當溫度不同,第二則可能是焙烤溫度較高,當持續升高至200 ℃時,蛋白質變性完全,其空間結構被毀壞并在其表面顯現出多量疏水性基團,分子間的相互作用力相對減少,蛋白質發生堆積沉淀現象,從而降低溶解性[23]。焙烤強度為150和180 ℃的綠豆蛋白的結構組成含量較為接近,但溶解度呈現相反的趨勢,可能是因為在加工過程中蛋白與酚類物質相互作用造成的。如圖3所示150和180 ℃溫度下1050 cm-1波長處均出現峰,且150 ℃時峰更明顯,推斷與蛋白結合的酚類物質含量較高,當蛋白與酚類物質發生互作時適量的酚會增加蛋白的功能性質,而過量的酚會造成蛋白的基礎功能性反而降低[24-26],可能是因為過量的多酚類成分阻礙了蛋白質中的親水性氨基酸的暴露[27]。

圖4 焙烤強度對綠豆蛋白溶解性的影響Fig.4 Effect of baking strength on solubility of Mung bean protein

2.5 持水、持油性分析

圖5為不同焙烤溫度下綠豆蛋白的持油性及持水性變化。由圖5可知綠豆蛋白的持水性隨焙烤溫度的升高出現先上升后降低再上升的變化,這與高柳等[28]對黑米蛋白持水性的研究結果相似。由圖可知熱加工后的蛋白持水性顯著高于生蛋白(P<0.05),但在150 ℃時與生蛋白持水性差異并不顯著,可能是由于溫度升高過程中加劇了蛋白質鏈的展開,蛋白分子中的氫鍵和離子鍵水合作用降低,增加聚集作用的形成[29]。隨后出現升高現象可能是由于溫度的升高在一定程度上改變了蛋白質內部結構,增大了延展性,使小分子水與大分子蛋白之間相互作用更為劇烈,則蛋白質吸水性增大,持水率增高。

圖5 焙烤強度對綠豆蛋白的持水、持油性的影響Fig.5 Effect of baking strength on water and oil holding capacity of mung bean protein

綠豆蛋白的持油性隨溫度逐漸降低后升高,當溫度在150 ℃以上時加工后的綠豆蛋白持油性均大于生蛋白,但相差并不顯著,此與高柳等[29]對大米谷蛋白的持油性結論相似。在起初溫度相對較低的焙烤條件下,蛋白質結構發生變化,極性鍵逐漸暴露,結合油脂能力降低并達到飽和,所以持油性下降。而隨著溫度的增高,蛋白質分子的結構又重新聚合可能更為緊密,油脂在蛋白的網狀結構里流動性相對較低,蛋白質分子會將其截留、包裹,持油性顯著增加。這可能與蛋白質的含量、類型以及氨基酸組成有關,特別是與脂肪分子中和烴鏈相互作用的疏水性殘基相關[30]。

2.6 乳化性、乳化穩定性分析

通過機械攪拌互不相溶的液體形成乳狀液的能力稱為乳化性。由圖6可知,生蛋白的乳化性較低,經過焙烤加工處理后的綠豆蛋白乳化性顯著增大(P<0.05),并隨著焙烤溫度的增加,呈現先降低后升高的變化趨勢。在150 ℃下焙烤的綠豆蛋白乳化性最低約為21.42 m2/g,當溫度大于150 ℃時,蛋白質經過熱變性,分子結構逐漸舒展開來,同時因溶解性的提高變得更加柔順,在乳化界面中也更容易擴散,從而提高了綠豆蛋白的乳化性。

圖6 焙烤強度對綠豆蛋白乳化性和乳化穩定性的影響Fig.6 Effect of baking strength emulsification and stability of mung bean protein

未進行熱加工的生蛋白乳化穩定性很高為50.86%,而隨著焙烤溫度的提升乳化穩定性顯著下降(P<0.05),在130 ℃下最低值為8.5%。焙烤溫度未達到蛋白變性適宜溫度時,不能充分打開蛋白肽鏈,很難形成空間網狀結構,所以乳化穩定性在降低,這與劉建壘等[31]對燕麥蛋白的乳化穩定性在隨溫度先下降后升高再下降的趨勢相似。熱動能會在焙烤溫度高于變性溫度時增加,這將會展開蛋白質結構并暴露出非極性基團,加速了綠豆蛋白質的聚集和沉淀,使其乳化性能急劇下降[32]。

2.7 起泡性、起泡穩定性分析

食品產品中蛋白質的起泡性和起泡穩定性極為重要。在液體和氣體相連接處蛋白質形成一層膜狀物質,并使氣體大量進入產生氣泡的能力即為起泡性。而蛋白質能夠使泡沫穩固的能力即為起泡穩定性[33]。由圖7可知,加工后綠豆蛋白的起泡性和起泡穩定性隨著溫度增高呈現先下降后上升再次下降的趨勢,且與生蛋白有較顯著差異(P<0.05),該情況和焙烤溫度與溶解性的關系極為相似,在焙烤溫度180 ℃下起泡性值最高為26%。鄭煜炎等[34]在溫度對米糠蛋白的影響中得出在溫度較低時起泡性隨溫度升高增大,當溫度超過某適當溫度值時起泡性會降低。而在游離于表面的蛋白質分子中,影響蛋白質起泡性的可能是疏水性氨基酸的數量[35]。從熱處理角度來看,它可能會使蛋白質打開后的肽鏈變得更為柔軟且更易展開,使蛋白質分子膨脹并吸附在氣體和液體相接觸的界面上;而另一程度上它會使疏水性氨基酸大量地暴露在空氣中,使蛋白質更易與空氣相融合[36]。而起泡穩定性下降可能由于加熱會導致空氣膨脹,產生的氣泡會發生破裂影響泡沫穩定。

圖7 焙烤強度對綠豆蛋白起泡性和起泡穩定性的影響Fig.7 Effect of baking strength foaming and stability of mung bean protein

3 結論

本研究通過對焙烤加工后的綠豆蛋白結構及功能特性變化規律進行研究,發現焙烤加工對綠豆蛋白的結構及功能性質都產生較大的影響。在電泳分析中,不同焙烤溫度下的綠豆蛋白主要有5個亞基條帶,分別為61.7、57.5、50.1、25.1和19.5 kDa,熱變性使得綠豆蛋白各亞基發生不同程度的降解,使蛋白條帶越來越淺。在紅外圖譜中,加工后蛋白質的基團不穩定使其發生紅移或藍移,在150和180 ℃時蛋白與醇、酚、胺類物質結合或發生美拉德反應使1050 cm-1波長處出現明顯的峰值,對蛋白酰胺Ⅰ帶進行擬合得出焙烤加工后β-折疊結構含量顯著增加,α-螺旋結構、β-轉角結構含量顯著降低。在焙烤加工下,綠豆蛋白的功能性質除乳化穩定性外均得到顯著提升,經過數據分析比較,焙烤加工后的綠豆蛋白與生蛋白相比,持水、持油性分別提高了47.4%、12.5%,起泡性和起泡穩定性分別提高了69.2%和22.7%,乳化性和溶解性分別提高了74%和47.72%,180 ℃的焙烤溫度可使綠豆蛋白功能性質提升到最佳。綜上,一般情況下植物蛋白的功能特性較差,但經過高溫焙烤熱處理后的綠豆蛋白變性后各個功能性質會更加優異。本實驗為綠豆蛋白在不同溫度焙烤下結構與功能性質的研究提供了理論參考,隨著綠豆蛋白在熱加工處理領域中的深入研究,可以更全面地利用綠豆蛋白的結構及功能性質開展應用。