馬鈴薯粗蛋白的提取工藝優化及體外抗氧化活性分析

張 莉,張建軍,郭永福,*,劉漢斌,*,李雅麗

(1.定西市人民醫院,甘肅定西 743000; 2.甘肅中醫藥大學定西校區,甘肅定西 743000)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)為重要的糧食作物和經濟作物,在世界各地100多個地區均有廣泛種植,馬鈴薯中的蛋白含量僅次于淀粉,約為4.6%,馬鈴薯蛋白含有19種氨基酸[1],營養價值與雞蛋中的蛋白接近[2]。按照分子量大小將馬鈴薯蛋白可分為糖蛋白、高分子量蛋白質、蛋白酶抑制劑3類,其中馬鈴薯糖蛋白約占蛋白總量的40%,蛋白酶抑制劑占蛋白總量的50%,近年來研究發現馬鈴薯蛋白酶抑制劑具有抗癌和調節飲食等功效[3],馬鈴薯糖蛋白具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、預防紫外線對皮膚傷害[6]等多種藥理活性,還具有酯酰基水解活性、凝膠性、起泡性、乳化性等多種優良加工特性,在食品、保健品以及制藥行業具有較高的潛在利用價值[2,7]。

馬鈴薯蛋白在我國的資源分布廣泛,主要為生產淀粉的過程中產生。據統計,1000 kg馬鈴薯在生產淀粉的過程中大約可以產生5～12 m3的廢液,其中含有1%～2%的蛋白質[8]。

這些蛋白質常常被廢棄或者用作豬飼料,并沒有高效提取開發利用。若能充分利用廢液中的馬鈴薯,不僅解決馬鈴薯生產淀粉過程中所產生的的環境污染和資源浪費的問題,而且對馬鈴薯蛋白相關產品的開發利用具有較高價值。但國內目前研究馬鈴薯蛋白瓶頸主要有:提取馬鈴薯蛋白的工藝尚不成熟[2,9-10],除雜過程繁雜且所需設備材料價格高昂,無法得到可用于食品級和藥用級別的馬鈴薯蛋白。文獻調研發現目前提取馬鈴薯蛋白的方法有:丙酮提取法、鹽提取法、三氯乙酸提取法、酚提取法、醇提取法[11-14]等,研究結果表明5種提取馬鈴薯粗蛋白的方法中,磷酸鹽緩沖液提取法得到的馬鈴薯粗蛋白含量最高[15,且得到馬鈴薯蛋白的活性較高。但對提取馬鈴薯蛋白的相關工藝并未做詳細研究。基于以上研究背景,本實驗采用響應面法對磷酸鹽緩沖液提取馬鈴薯粗蛋白的工藝進行優化,并研究馬鈴薯粗蛋白的體外抗氧化活性,以期為馬鈴薯更合理、更環保得用于制藥行業以及食品業奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.) 購自甘肅省定西市安定區西巖路菜市場;鄰苯三酚、KH2PO4、Na2HPO4、NaHSO3、乙醇(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;考馬斯亮藍G250(Ultra Pure Grade,No.C8816) Solarbio;牛血清白蛋白(No. B0052) Roche;1,1-二苯基-2苦肼基(DPPH)、2,2-聯氨雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2-azinobis)(3-ethylbenzothia-zoline)-6-sulfonate,ABTS) 美國Sigma-Aldrich公司。

VFD1000型真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;KDC-160HR型高速冷凍離心機 科大創新股份有限公司;PHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠;TU-1950型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;FA2104N型分析天平 上海民橋精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬鈴薯粗蛋白提取工藝流程 參考陳美林等[15]提取馬鈴薯粗蛋白的方法,將新鮮馬鈴薯洗凈,切成約1 cm3的小塊,稱取0.50 g,采用1% NaHSO3溶液護色10 min,取出馬鈴薯塊,置于破壁機中,加入40 mL磷酸鹽緩沖液,研磨至勻漿后,加入磷酸鹽緩沖液定容至50 mL,靜置1 h,充分提取馬鈴薯粗蛋白,離心:5000 r/min,4 ℃離心5 min,棄渣取上清液,在上清液中加入95%(NH4)2SO4,并且邊加入(NH4)2SO4邊勻速攪拌,于冰箱中冷藏,靜置過夜,取出,離心(4000 r/min,20 min),棄上清液取沉淀,用磷酸鹽溶液溶解沉淀,溶液在 4 ℃下,透析,3 d后,吸取5 mL透析液置于玻璃試管,加入適量酸性硝酸鋇溶液,沒有白色沉淀析出,取出蛋白溶液,4000 r/min 離心20 min,取上清液,冷凍干燥,48 h后取出得到粉末干燥物,密閉保存。

1.2.2 單因素實驗 準確稱取0.50 g的新鮮馬鈴薯,置于1%的NaHSO3溶液護色,加入一定量的磷酸鹽緩沖液研磨成勻漿后備用。經查閱文獻,影響蛋白提取的關鍵因素有:提取時間、料液比、粒度等[16-20],因此選擇馬鈴薯粉碎粒度、提取時間、料液比為單因素,分別考察其對馬鈴薯粗蛋白含量的影響。其中粒度分別選擇藥典1號篩(10目)、3號篩(50目)、5號篩(80目)、7號篩(120目)、9號篩(200目),提取時間分別選擇1、2、3、4、5、6 h,料液比分別選擇1∶6、1∶10、1∶14、1∶18、1∶22、1∶26 g/mL。各因素固定水平值:粒度為80目(5號篩),提取時間1 h,料液比1∶10 g/mL。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗結果的基礎上,利用 Design-Expert 8.0.6 軟件進行3因素3水平試驗設計,以粒度、提取時間、料液比為自變量,以馬鈴薯粗蛋白含量為響應值,建立二次回歸模型,根據模型得到提取馬鈴薯粗蛋白的最佳工藝條件并進行驗證。具體因素與水平設計見表1。

表1 響應面因素水平設計Table 1 Factors and level value of response surface methodology

1.2.4 考馬斯亮藍法測定粗馬鈴薯粗蛋白質含量 標準曲線制作:精密稱取0.1007 g牛血清白蛋白,定容至100 mL,配制成1 mg/mL的溶液,分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2 mL溶液置于10 mL容量瓶中定容。分別移取0.5 mL牛血清白蛋白溶液置于試管中,加入5 mL考馬斯亮藍G-250顯色液,搖勻,靜置5 min,于595 nm下測定其吸光度,以粗蛋白質含量(mg)為橫坐標x,以吸光度y為縱坐標繪制標準曲線:y=0.290x-0.01,R2=0.998。

樣品的測定:取0.5 mL馬鈴薯提取液置于試管中,加入5 mL考馬斯亮藍顯色液,放置5 min,于595 nm下測定吸光度,空白為0.5 mL蒸餾水代替馬鈴薯粗蛋白提取液。每個樣品重復測定3次,通過標準曲線計算馬鈴薯粗蛋白含量。

樣品中蛋白質含量(mg/g)=(C×N×Vt)/Wf

式中:C為查標準曲線值(mg/mL),N為稀釋倍數,Vt為提取液總體積(mL),Wf為樣品鮮重(g)。

1.2.5 馬鈴薯粗蛋白體外抗氧化實驗 在最優提取條件下獲得的馬鈴薯蛋白粉末,分別配制成質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的馬鈴薯蛋白溶液,以VC為對照組進行體外抗氧化活性實驗。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 1,1-二苯基-2苦肼基(DPPH)自由基清除能力的測定參考趙武[21]等的方法進行試驗,并稍作修改。利用移液槍分別移取5 mL質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的馬鈴薯蛋白溶液和相同質量濃度的VC溶液置于棕色試管中,加入2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液搖勻,避光反應30 min,在595 nm波長處測定溶液的吸光度,每個質量濃度設置3個平行試驗,取平均值,并依據下式計算DPPH自由基清除率:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

其中:A1為樣品與DPPH混合液的吸光度,A2為樣品與無水乙醇混合液的吸光度,A0為蒸餾水與DPPH混合液的吸光度。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除能力測定 2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除能力的測定參考Wang等[22]的方法并稍作修改。依據ABTS試劑盒的說明,配制好ABTS工作液,30 ℃水浴中避光孵育10～30 min,利用移液槍分別移取2 mL不同質量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)的馬鈴薯蛋白溶液和相同質量濃度的VC溶液置于棕色具塞刻度試管中,再加入4 mL的ABTS工作液,在30 ℃水浴中避光反應6 min,595 nm波長處測定吸光度,每個質量濃度設置3組平行試驗,取平均值,并依據下式計算其對ABTS+自由基的清除率:

ABTS+自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

其中:A1為樣品與ABTS混合液的吸光度,A2為樣品與甲醇混合液的吸光度,A0為蒸餾水與ABTS混合液的吸光度。

1.2.5.3 ·OH自由基清除能力測定 羥自由基清除能力的測定參考王晗等[23]的方法進行試驗并稍作修改。利用移液槍準確吸取不同質量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)的馬鈴薯蛋白溶液和相同質量濃度的VC溶液各2 mL,置于具塞試管中,然后依次加入2 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL 9 mmol/L的水楊酸溶液和2 mL 9 mmol/L的雙氧水溶液,充分混合均勻,置于 37 ℃水浴中反應30 min,于595 nm波長處測定吸光度,每個濃度設置3個平行試驗,取平均值,并依據下式計算羥基自由基的清除率:

·OH清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

其中:A0為FeSO4溶液、H2O2溶液、水楊酸和蒸餾水混合液的吸光度;A1為FeSO4溶液、H2O2溶液、水楊酸和樣品溶液混合液的吸光度;A2為FeSO4溶液、蒸餾水、水楊酸和樣品溶液混合液的吸光度。

1.3 數據處理

標準曲線繪制及單因素實驗數據處理采用Excel作圖,采用Design expert 8.0.6進行響應面實驗數據優化,用SPSS 21.0軟件進行方差分析,以P<0.05表示有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 粒度對馬鈴薯粗蛋白含量的影響 由圖1可知,隨著粒度的減小目數的增大,馬鈴薯粗蛋白含量顯著增加,當粒度增加到50目時,馬鈴薯粗蛋白含量達到最大;當粒度繼續增大至50～200目范圍內時,馬鈴薯粗蛋白含量逐漸降低,因此,選擇50目為響應面提取馬鈴薯粗蛋白的中心點。

圖1 不同粒度對馬鈴薯粗蛋白含量的影響Fig.1 Effect of different particle size on potato protein content

2.1.2 提取時間對馬鈴薯粗蛋白含量的影響 由圖2可知,在前4 h之內,隨著提取時間的增加,馬鈴薯粗蛋白含量也隨之提高,當提取時間超過4 h以后,馬鈴薯粗蛋白含量出現拐點,即隨著提取時間的延長,馬鈴薯粗蛋白含量不再增加反而顯著(P<0.05)降低。這可能是由于隨著提取時間的延長,馬鈴薯中的粗蛋白質的溶出隨之增大,當提取時間達到4 h時,馬鈴薯粗蛋白溶出達到飽和,若再繼續延長提取時間,馬鈴薯中的粗蛋白出現凝聚沉淀與殘渣一同被離心除去會降低蛋白質的提取效率[24-26]。因此,選擇4 h為響應面提取馬鈴薯粗蛋白的中心點。

圖2 不同提取時間對馬鈴薯粗蛋白含量的影響Fig.2 Effect of different extraction time on potato protein content

2.1.3 料液比對馬鈴薯粗蛋白含量的影響 由圖3可知,當料液比在1∶6～1∶22 g/mL范圍內時,隨著提取溶劑的增多,馬鈴薯粗蛋白含量逐漸升高,當料液比為1∶22 g/mL時馬鈴薯粗蛋白含量達到最大,此時若繼續增加提取溶劑的量,馬鈴薯粗蛋白含量反而顯著降低,因此最終選擇1∶22 g/mL為響應面提取馬鈴薯粗蛋白的中心點。

圖3 不同料液比對馬鈴薯粗蛋白含量的影響Fig.3 Effect of different feed-liquid ratios on potato protein content

2.2 響應面法優化馬鈴薯粗蛋白提取工藝

2.2.1 響應面法優化實驗設計及結果 采用Design Expert 8.0.6軟件的ANOVA分析表2中的響應面回歸參數,得到回歸方程:Y=0.24+0.077A+0.012B+0.020C+9.6×10-3AB+0.020AC+0.012BC-0.052A2-0.053B2-0.035C2。

表2 響應面優化實驗結果Table 2 Results of response surface experiments

表3 方差分析結果Table 3 The result of variance analysis

圖4 粒度和提取時間交互作用的等高線和響應面圖Fig.4 Contour and response surface diagram of interaction between particle size and extraction time

圖5 粒度和料液比交互作用的等高線和響應面圖Fig.5 Contour and response surface diagram of interaction between particle size and material-liquid ratio

圖6 提取時間和料液比交互作用的等高線和響應面圖Fig.6 Contour and response surface diagram of interaction between extraction time and material-liquid ratio

2.2.2 雙因素間交互作用影響 三因素間交互作用對馬鈴薯粗蛋白含量的影響見圖4、圖5、圖6,若三維圖坡面較陡峭,等高線圖呈橢圓形,表明兩因素交互作用對馬鈴薯蛋白含量影響較大。由圖4可知,粒度和提取時間交互作用對馬鈴薯粗蛋白含量的影響極顯著,由圖5可知,粒度和料液比交互作用對馬鈴薯粗蛋白含量的影響極顯著,由圖6可知,提取時間和料液比交互作用對馬鈴薯粗蛋白含量的影響顯著。

2.2.3 提取馬鈴薯粗蛋白最優工藝條件的確定和驗證 根據Design Expert 8.0.6軟件優化提取馬鈴薯粗蛋白的最佳工藝條件:粒度為80目,提取時間為4.28 h,料液比為1∶24.5 g/mL,此時馬鈴薯粗蛋白含量為0.28 mg/g。為了實際試驗過程中的可操作性,選擇粒度為80目,提取時間為4 h,料液比為1∶25 g/mL進行驗證試驗,試驗重復6次,得到馬鈴薯粗蛋白含量為0.27±0.005 mg/g與預測值0.28 mg/g相對誤差為2.53%,表明實驗值與預測值吻合良好,優化后的提取馬鈴薯粗蛋白的方法工藝可行,可用于實際工業操作生產。

2.2.4 馬鈴薯粗蛋白抗氧化實驗 馬鈴薯粗蛋白對DPPH·的清除作用如圖7所示,由圖7可知,馬鈴薯蛋白具有一定的抗氧化能力,但與VC相比,其抗氧化能力相對較弱。當質量濃度在0.2～1 mg/mL范圍內時,隨著馬鈴薯蛋白質量濃度的增加,對DPPH·的清除能力增加,其半數清除濃度IC50為0.247 mg/mL。

圖7 馬鈴薯蛋白對DPPH·的清除作用Fig.7 Scavenging effect of potato protein on DPPH·

馬鈴薯粗蛋白對ABTS+的清除作用如圖8所示,由圖8可知,馬鈴薯蛋白質量濃度在0.2～1 mg/mL范圍內,隨著馬鈴薯蛋白質量濃度的增加,對ABTS+·的清除能力增加,但與活性強的VC相比,其清除ABTS+·的能力相對較弱。

圖8 馬鈴薯蛋白對ABTS+·的清除作用Fig.8 Scavenging effect of potato protein on ABTS+·

馬鈴薯粗蛋白對·OH的清除作用如圖9所示,由圖9可知,馬鈴薯蛋白質量濃度在0.2～1 mg/mL范圍內時,隨著馬鈴薯蛋白質量濃度的增加,對·OH的清除能力增加,但與抗氧化活性強的VC相比,其對·OH的清除能力較弱。其半數清除濃度IC50為0.496 mg/mL。

圖9 馬鈴薯蛋白對·OH-的清除作用Fig.9 Scavenging effect of potato protein on ·OH-

3 結論

本實驗通過響應面法來優化磷酸鹽緩沖液提取馬鈴薯蛋白的工藝,以馬鈴薯的粉碎粒度、提取時間、料液比為單因素,以馬鈴薯蛋白含量為響應值,采用Design Expert 8.0.6軟件優化馬鈴薯粗蛋白的最佳提取工藝,最后得到馬鈴薯粗蛋白的最佳提取工藝為粒度80目,提取時間4 h,料液比1∶25 g/mL,此時得到馬鈴薯粗蛋白的含量為0.27 mg/g,與預測值0.28 mg/g接近。相對誤差為2.56%。在此基礎上研究了馬鈴薯粗蛋白的抗氧化活性。體外抗氧化實驗表明,馬鈴薯粗蛋白對ABTS+·、DPPH·、·OH-均具有一定程度的清除能力,當濃度為1 mg/mL時,其對ABTS+·清除率高達92.54%,但與活性較強的VC溶液相比,其抗氧化能力相對較弱。本實驗提供了一種提取馬鈴薯蛋白的工藝條件,為工業上更廣泛開發利用馬鈴薯蛋白提供科學依據。但本研究只得到馬鈴薯蛋白的粗提物,對馬鈴薯粗蛋白的純化及相關產品的研究尚待更進一步研究。