母親還原葉酸載體基因多態性與子代先天性心臟病關聯的病例對照研究

秦家碧 盛小奇 王婷婷 黃鵬 李依寰 羅柳 劉亦萍 刁靜怡 朱平

（1.廣東省人民醫院/廣東省醫學科學院，廣東廣州 510100；2.中南大學湘雅公共衛生學院流行病與衛生統計系，湖南長沙 410078；3.湖南省婦幼保健院國家衛健委出生缺陷研究與預防重點實驗室，湖南長沙 410008；4.湖南省兒童醫院心胸外科，湖南長沙 410007）

先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）是指胚胎發育時期由于心臟及大血管的形成障礙而引起的局部解剖結構異常，或出生后應閉合的通道未閉合而引起的心臟、血管功能異常，是我國最常見的出生缺陷和嬰幼兒非感染性死亡的主要原因。全球發病率為8.22‰［1］，我國為8.98‰［2］，發病呈逐年上升趨勢［3］。此外，即使經過有效干預，CHD患者仍存在較高的心血管疾病及死亡風險，并可能在行為、認知、注意力和運動表現等方面存在功能缺陷［4-5］。同其他復雜疾病一樣，CHD病因涉及遺傳和環境因素。流行病學證據顯示圍孕期增補葉酸或含葉酸的多種維生素能有效降低CHD的發生風險［6］，但這種危險降低的機制并不清楚。調查與葉酸代謝、吸收和轉運相關酶基因的遺傳變異有助于解釋葉酸相關出生缺陷的發生機制。許多學者已經將焦點集中于影響葉酸代謝的酶基因上，包括5,10亞甲基四氫葉酸還原酶基因、蛋氨酸合酶還原酶基因、胱硫醚β合酶基因等［7-8］。然而，在機體利用葉酸過程中，除上述與葉酸代謝有關的酶外，尚有葉酸轉運過程中涉及到的受體及載體，如葉酸受體和還原葉酸載體（reduced folate carrier，RFC）也在葉酸吸收轉運進入細胞過程中發揮關鍵作用［9］。因此，RFC基因的突變或表達異常可能成為孕母葉酸正常代謝過程的重要影響因素。值得注意的是，雖然有研究顯示RFC基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與CHD發生存在關聯［10］，但這些研究只關注了該基因的一個位點（rs1051266）。RFC基因上除了已經關注的位點外，尚有其他SNP位點。本研究首次關注母親RFC基因多個位點（rs10483080、rs2236484、rs3788190、rs3788189、rs12483377、rs2330183） 與子代CHD的關聯，能為CHD遺傳易感因素研究提供流行病學依據，也為揭示葉酸預防出生缺陷的潛在作用機制提供線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象

采用以醫院為基礎的病例對照研究，招募2017年11月至2020年3月在湖南省兒童醫院心胸外科就診的683例CHD嬰兒的母親為病例組。診斷的CHD亞型包括：房間隔缺損、室間隔缺損、房室隔缺損、動脈導管未閉、主肺動脈隔缺損、法洛四聯癥、完全大動脈轉位。招募同期因感冒、腹瀉、外傷等就診于同一家醫院并排除任何畸形的740例嬰兒的母親為對照組。

1.2 納入與排除標準

所有CHD患兒均為單純性CHD，排除其他系統畸形，均符合臨床診斷標準，并且經心臟彩超或術中探查證實。對照組患兒經體檢初篩及心臟彩超證實心臟結構、功能均正常，且無染色體異常及系統性畸形等疾病。研究對象需滿足以下標準：（1）了解本項目并簽署知情同意，愿意配合本課題調查研究；（2）彼此無親緣關系；（3）完成調查問卷并愿意提供血標本用于本課題基因SNP檢測；（4）漢族；（5）單胎受孕。本研究排除輔助生殖技術受孕、多胎受孕或患有精神障礙性疾病不能配合完成調查的產婦。為了降低對孕前或孕期環境暴露的回憶偏倚，本研究也排除產后超過1年的產婦。

1.3 問卷調查

本研究使用統一的問卷調查表，所有調查員經過統一培訓，以訪談的形式對研究對象進行流行病學問卷調查。調查內容包括：產婦基本社會人口學特征（孕齡、文化程度、家庭年收入、民族、戶籍等）、出生缺陷家族史、個人先天畸形史、家族近親婚配史、既往不良妊娠史（自然流產、死胎或死產、早產、低出生體重、妊娠糖尿病、妊娠高血壓等）、圍孕期感冒和發熱史、圍孕期生活行為史（主動吸煙、二手煙暴露、飲酒史等）、圍孕期葉酸補充情況、圍孕期環境污染物接觸史等。圍孕期定義為懷孕前3個月至懷孕后12周。為防止回憶偏倚，本研究結合孕母婦幼保健手冊，以進一步確認圍孕期相關暴露信息。

1.4 基因多態性檢測

完成問卷后，采集產婦5 mL靜脈血用于基因SNP檢測。本研究選擇RFC基因作為備檢基因，并參考已發表的文獻［11］所介紹的方法來選擇相關候選位點。檢索NCBI和HapMap數據庫，查詢并核實RFC基因主要的SNP位點，要求選擇tanSNP時r2所設的閾值不小于0.8，且最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）不低于10%。最終，6個 位 點 （rs10483080、rs2236484、rs3788190、rs3788189、rs12483377、rs2330183）被確定為本研究的待檢位點。采用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA，USA）提取血細胞中的DNA，用紫外分光光度計測定DNA溶液的濃度和純度。應用MassARRAY飛行時間質譜對6個位點的SNP進行檢測，具體檢測工作由博淼生物科技（北京）有限公司完成。

1.5 統計學分析

采用EpiData 3.1軟件建立數據庫，應用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計數資料采用率或構成比（%）描述，組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法；等級資料比較采用Wilcoxon秩和檢驗。對對照組人群基因型分布頻率進行哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗（如果P＞0.01，說明對照樣本符合HWE）。采用logistic回歸模型計算優勢比（odds ratio，OR）和95%置信區間（confidence interval，CI），以評估RFC基因SNP與CHD的關聯性。采用基因模型選擇（genetic model selection，GMS）的方法判定各位點與疾病關聯的遺傳模型［當哈迪-溫伯格不平衡趨勢檢驗 （Hardy-Weinberg disequilibrium trend test，HWDTT）ZHWDTT＜-1.645時，判定為顯性模型；ZHWDTT＞1.645時，判定為隱性模型；ZHWDTT＞-1.645或ZHWDTT＜1.645時，判定為加性模型］。利用Haploview 4.2軟件計算各位點之間的r2值，r2＞0.8表明兩個位點之間存在連鎖不平衡；同時，利用四配子檢驗的方法構建單倍型，并評估各單倍型與CHD發生的關聯。采用廣義多因子降維法探討各位點間交互作用與CHD發生的關聯。涉及多重比較時，采用錯誤發現率（false discovery rate，FDR）校正的方法調整P值以控制假陽性率，得到校正P值（QFDR），并以QFDR≤0.05作為差異有統計學意義的判定標準。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較

病例組和對照組產婦戶籍、文化程度、家庭年收入、家族出生缺陷史和近親婚配史、既往不良妊娠史（死胎或死產、妊娠糖尿病、妊娠高血壓）及圍孕期感冒或發熱史、葉酸補充、不良生活習慣（主動或被動吸煙、飲酒）和環境污染物接觸史方面比較差異有統計學意義（P＜0.05），這些因素將作為后續多因素分析的混雜因素進行控制，見表1。

表1 病例組和對照組的基線資料比較 ［例（%）］

2.2 母親RFC基因多態性與子代CHD的關聯分析

HWE檢驗顯示，對照組人群RFC基因有1個位點（rs10483080）的基因型分布不符合HWE（P＜0.001），因此后續分析中不納入該位點（表2）。多因素logistic回歸分析顯示，在調整表1基線資料比較中差異有統計學意義的混雜因素后，母親RFC基因的兩個位點rs2236484和rs2330183的多態性與CHD風險存在關聯（表3）。在位點rs2236484上，攜帶AG（OR=1.91，95%CI：1.45～2.51；QFDR＜0.001）或GG（OR=1.96，95%CI：1.40～2.75；QFDR＜0.001）基因型的母親與攜帶AA基因型相比，子代CHD的風險顯著增加；該位點的顯性模型（OR=1.93，95%CI：1.48～2.50；QFDR＜0.001）和加性模型（OR=1.43，95%CI：1.21～1.69；QFDR＜0.001）與CHD風險存在關聯。在位點rs2330183上，攜帶CT（OR=1.39，95%CI：1.06～1.83；QFDR=0.045） 基因型的母親與攜帶CC基因型比較顯著增加了子代CHD的風險；該位點顯性模型（OR=1.39，95%CI：1.07～1.79；QFDR=0.030）與CHD風險存在關聯。

表2 母親RFC基因型分布頻數及HWE檢驗 （例）

表3 母親RFC基因多態性與CHD關聯的logistic回歸分析

表3 （續）

2.3 母親RFC基因各位點遺傳模型分析

基于HWDTT，利用病例組和對照組在各位點不同基因型頻率，計算各位點對應的統計量ZHWDTT，并通過與C=1.645相比，判定各位點的遺傳模型，結果見表4。可見，母親RFC基因與子代CHD風險存在關聯的兩個位點rs2236484和rs2330183的遺傳模型均為顯性模型。

表4 各位點遺傳模型分析

2.4 連鎖不平衡及單倍型分析

連鎖不平衡分析顯示，母親RFC基因的兩個位點rs3788189和rs3788190之間存在連鎖不平衡（r2=0.916），提示兩個位點間強關聯（表5）。單倍型分析顯示，RFC基因的5個位點共形成2個單倍型塊（Block）。Block1涉及兩個位點rs12483377和rs2236484，構成3種單倍型：G-A、G-G和A-G。Block2涉及兩個位點rs3788189和rs3788190，構成3種單倍型：G-A、T-G和G-G（圖1）。在Block1中，母親攜帶單倍型G-G（OR=1.21，95%CI：1.03～1.41）顯著增加子代CHD的風險；在Block2中，母親攜帶單倍型T-G（OR=1.25，95%CI：1.07～1.46）顯著增加子代CHD的風險（表6）。

2.5 位點間交互作用分析

采用廣義多因子降維法分析RFC基因各位點間的交互作用。結果顯示，2個位點（rs2236484和rs2330183）的一階交互作用、3個位點（rs2236484、rs3788189和rs2330183）的二階交互作 用 、4個 位 點 （rs2236484、rs3788189、rs12483377和rs2330183）的三階交互作用可能與CHD的發生風險存在關聯（P=0.001），見表7。

表5 基因位點連鎖不平衡檢驗

圖1 RFC基因各位點連鎖不平衡圖 圖中紅色方框代表位點連鎖不平衡的程度，顏色越深表示位點之間連鎖不平衡強度越強。框中數值為連鎖不平衡指標的具體值，接近于100，提示兩位點之間連鎖不平衡強度越強；接近于0，則提示兩位點連鎖不平衡強度越弱，即趨向于遺傳平衡。數字1～5分別對應數字上方的位點rs號。

表6 單倍型分析及其在病例組和對照組中的分布情況

表7 RFC基因各位點間交互作用分析

3 討論

母親妊娠前后增補葉酸或含葉酸的維生素可以有效降低神經管畸形、唇腭裂及CHD的發病風險［6，12-13］。因此，圍孕期增補葉酸已成為預防神經管畸形等先天缺陷的一級預防措施。然而，妊娠期增補葉酸可以降低出生缺陷發生風險的機制仍不清楚。研究影響葉酸的細胞吸收、轉運及代謝的遺傳變異能幫助解釋一部分葉酸相關出生缺陷的發病機制。目前，國內外的研究大多只關注葉酸代謝相關基因的遺傳變異對CHD的影響。本研究分析了母親RFC基因的6個SNP與子代CHD的關聯。結果表明，RFC基因rs2236484和rs2330183位點的多態性與子代CHD的發生顯著相關。RFC基因位于21號染色體（21q22.2-22.3），編碼分子量在80～120 kDa間的膜蛋白，對還原葉酸具有高親和力［14］。RFC主要的生理功能是與葉酸受體共同作用完成葉酸從組織到細胞內的轉運，介導葉酸在腸道的吸收，以維持細胞內的葉酸濃度［15］。作為葉酸轉運的主要載體，還原葉酸載體促進葉酸向胎盤的轉移，有利于DNA合成和細胞增生，對胚胎的生長和分化具有重要意義［16］。已有研究表明RFC基因多態性與血漿中葉酸水平降低和同型半胱氨酸水平升高顯著相關［14］。因此，RFC基因突變或異常表達可能導致RFC酶活性降低，RFC轉運葉酸能力下降，葉酸的正常代謝受到影響進而導致組織發育異常，從而增加CHD的風險［17］。

既往關于RFC基因多態性與疾病的研究多集中在神經管畸形和顱面畸形［9，18-19］，僅有3項研究評估了其與CHD的關聯［10，20-21］。但是這些研究都只關注了RFC基因上的一個位點rs1051266（A80G），結果表明rs1051266位點突變與子代CHD、神經管畸形及顱面畸形等出生缺陷的高患病風險存在關聯［10，20-21］。本研究首次關注了RFC基因上多個位點 （rs10483080、rs2236484、rs3788190、rs3788189、rs12483377、rs2330183）與子代CHD的關系，為揭示RFC基因的遺傳變異與CHD發病機制的關系提供潛在的線索。此外，本研究還對各位點的遺傳模型進行了篩選并在分析單個位點基因多態性的基礎上進行了單倍型分析。由于在復雜疾病的研究中很難事先明確基因的遺傳模式，且錯誤的遺傳模型會降低分析的檢驗效能，因此對單個位點的遺傳模型進行篩選能更清晰地明確基因在疾病發生中的作用［22-23］。RFC基因各位點的遺傳模型分析結果顯示，與子代CHD發生相關的rs2236484和rs2330183位點均為顯性模型。單倍型是等位基因的線性排列，具有整體遺傳的趨勢［24］。在基因與疾病的關聯分析中結合單倍型有助于更精準地定位致病基因。RFC基因的5個位點共形成2個單倍型塊，Block1中的單倍型G-G與Block2中的單倍型T-G均顯著增加子代CHD的風險。

本研究的局限性：第一，作為一項以醫院為基礎的病例對照研究，本研究在資料的收集上不可避免地存在回憶偏倚。為了減少這種偏倚，選擇1歲以內兒童的母親作為研究對象并結合孕母婦幼保健手冊確認圍孕期相關暴露信息。第二，本研究只納入活產住院的CHD患者，那些因為CHD流產的病例并未納入，這可能導致選擇性偏倚。第三，由于樣本量的限制，本研究未對RFC基因多態性與不同CHD亞型的關聯進行評估。

綜上所述，母親RFC基因兩個位點（rs2236484和rs2330183）的遺傳變異與子代CHD的發生風險升高顯著相關，并且該基因各位點之間在CHD的發生中存在交互作用，這為CHD遺傳易感因素的研究提供了新的流行病學證據，也為揭示葉酸預防出生缺陷的潛在作用機制提供線索。然而，RFC基因的遺傳變異如何影響CHD發生的潛在機制仍不明確，未來需要開展更多研究。

志謝：本研究得到了湖南省兒童醫院心胸外科的全力支持。該科室工作人員在繁忙的工作中承擔了收集病例資料及收集標本的任務，同時為我們進行現場調查提供支持。在此，我們對該科室工作人員表示誠摯的感謝！

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。