兒童急性巨核細胞白血病臨床特點及預后分析

羅鐵梅 于潔 安曦洲

（重慶醫科大學附屬兒童醫院血液腫瘤科/國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/兒科學重慶市重點實驗室，重慶 401122）

急性巨核細胞白血病（acute megakaryocytic leukemia，AMKL） 是急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的一個亞型，FAB分型為AML-M7型［1］，約占兒童AML 5%～15%［2-4］，發病中位年齡為1.4～2歲［2-3，5］。AMKL骨髓巨核細胞在光鏡下較難辨認，可伴骨髓纖維化等原因易誤診［6］。根據患兒是否伴有唐氏綜合征（Down syndrome，DS），將AMKL分為DS-AMKL及非DSAMKL［7］。DS-AMKL患兒采用較低強度的單純化療即可實現持續完全緩解（complete remission，CR），其總生存（overall survival，OS） 率可達79%～91%［7-8］，而非DS-AMKL對標準化療反應不佳，復發率高，OS率僅為53%～70%［2，5，9-11］。本研究根據白血病細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學和分子生 物 學 （morphology，immunology，cytogenetics，molecular biology，MICM）分型及微小殘留病（minimal resident disease，MRD）作為危險度分級指標，參考美國兒童腫瘤協作組AML方案［12］制定AML03方案，旨在分析AMKL患兒的臨床特點、療效及預后影響因素。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2011年5月至2019年12月間在我院診治的47例AMKL患兒為研究對象。納入標準：（1）年齡0～18歲，新診斷AMKL，外院未行化療治療；（2）經骨髓涂片、骨髓活檢、免疫分型確診為AMKL，診斷標準為：骨髓原始細胞≥20%，其中50%以上為巨核細胞系或者原始細胞通過流式細胞術和/或免疫組織化學染色至少表達一種血小板糖蛋白（CD41、CD61或CD42）［1］；（3）本研究經重慶醫科大學附屬兒童醫院醫學倫理委員會審查并批準［（2015）年倫審（研）第（28-1）號］，治療前所有入組患兒家長均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集

對診斷為AMKL患兒自確診之日起進行病歷資料收集及電話隨訪，隨訪終點時間為2020年6月1日。根據入組患兒年齡、性別，是否有肝脾、淋巴結腫大，初診血常規，MICM分型，早期治療反應（骨髓細胞學及MRD結果），是否行異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplant，allo-HSCT）等因素進行分組。

1.3 治療方案

AML03方案（中高危組）：

（1）誘導Ⅰ：ADE（10+3+5）方案：阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C）200 mg/（m·2d）×10 d靜脈滴注；柔紅霉素 （daunorubicin，DNR）50 mg/（m·2d）×3 d靜脈滴注；依托泊苷（etoposide，VP16）100 mg/（m2·d）×5 d靜脈滴注。

（2）誘導Ⅱ：AM/AI方案：Ara-C 2 g/（m·2d）×4 d靜脈滴注；米托蒽醌12 mg/（m2·d）×4 d或伊達比星10 mg/（m2·d）×2 d靜脈滴注。

（3） 強化I：AE方案：Ara-C 2 g/（m2·d） ×5 d靜脈滴注；VP16 150 mg/（m2·d） ×5 d靜脈滴注。

（4） 強化II：AL方案：Ara-C 6 g/（m2·d）×4 d靜脈滴注；左旋門冬酰胺酶（L-asparaginase，L-Asp）：6 000 U/m2×2 d肌肉注射。

（5）神經系統白血病防治：甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）、地塞米松（dexamethasone，Dex）、Ara-C三聯鞘內注射共4次（年齡＜1歲：MTX 6 mg、Dex 2.5 mg、Ara-C 15 mg； 年 齡1～＜3歲：MTX 9 mg、Dex 2.5 mg、Ara-C 25 mg；年齡≥3歲：MTX 12.5 mg、Dex 5 mg、Ara-C 35 mg）。

（6）造血干細胞移植：5例患兒獲CR后行allo-HSCT，其中1例為DS-AMKL患兒。3例行親緣人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）不全相合allo-HSCT，1例行同胞HLA全相合allo-HSCT，1例行無關供者HLA全相合allo-HSCT。

1.4 療效及隨訪評估

骨髓檢查為治療評價主要指標，在四療程化療前和/或化療后完善骨髓細胞學及MRD監測。骨髓CR定義為：骨髓增生活躍或明顯活躍，骨髓白血病細胞＜5%。復發定義為：CR后任何時候外周血出現原始幼稚細胞或骨髓白血病細胞＞5%或出現髓外白血病。OS期定義為從確診之日開始到死亡或末次隨訪；無事件生存（event-free survival，EFS）期定義為從確診之日開始到發生任何事件（事件包括復發、死亡或發生二次腫瘤）。

1.5 MRD

初診時即采集骨髓使用流式細胞術對AML-MRD篩查標記，化療后再采集骨髓送檢MRD（北京康圣環球公司），MRD陰性定義為：MRD＜0.1%。

1.6 MICM分型檢測

初診時需完善MICM分型檢查，具體方法如下：

（1）骨髓細胞形態學：骨髓細胞涂片行常規瑞氏染色，分析細胞形態及細胞化學染色特點。

（2）免疫分型檢測：采用流式細胞術進行免疫分型檢測。

（3）染色體核型檢測：采用G顯帶技術進行核型分析。

（4）融合基因檢測：抽取骨髓用乙二胺四乙酸抗凝后行多重巢式逆轉錄-聚核酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）檢測。

（5）基因突變檢測：采用RT-PCR、PCR和/或二代測序技術，篩選并記錄與白血病發病或預后相關的突變基因。

1.7 統計學分析

應用SPSS 25.0統計軟件對數據進行統計學分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，非正態分布計量資料以中位數（范圍）表示；計數資料使用百分率（%）表示。采用Kaplan-Meier生存分析及log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料

47例AMKL患兒中，男21例，女26例，男女比例為1∶1.2。發病中位年齡為22.2（4.6～104.8）個月。患兒初診臨床癥狀和體征：出血為87%（41/47），發熱為64%（30/47），貧血為96%（45/47），肝臟腫大（≥2 cm）為64%（30/47），脾臟腫大為45%（21/47），淋巴結腫大為38%（18/47），骨浸潤為19%（9/47），有3例患兒伴骨髓纖維化。血常規提示血紅蛋白（Hb）為79（24～118）g/L， 白 細 胞 （WBC） 計 數 為13.5（2.3～153.8） ×109/L，血小板 （PLT） 計數為23（7～271）×109/L，31例患兒外周血發現幼稚細胞，幼稚細胞的百分比為16%（0%～77%）。

2.2 MICM結果

47例AMKL患兒的骨髓涂片結果顯示原始及幼稚巨核細胞/原始細胞的中位數為55.5%（7.0%～86.5%）。幼稚巨核細胞形態特點為：胞體大小不等，邊緣不齊，呈云霧狀或粗毛刺狀，胞漿呈深藍色不透明，著色不均，可見偽足樣突起，部分可見少許顆粒，核染色質疏松網狀，核仁不清，部分原巨核細胞邊緣有產生PLT現象，或伴有網狀纖維增生。95.3%過氧化物酶染色為陰性。

31例患兒白血病免疫分型結果分析：CD41陽性占81%（25/31），CD61陽性占50%（15/30），CD42陽性占62%（13/21），CD36陽性占68%（21/31），CD117陽性占68%（21/31），CD13陽性占52%（16/31），CD33陽 性占77%（24/31），CD56陽性占32%（10/31），HLA-DR陽性占52%（16/31）。

35例患兒初診時染色體核型結果分析：正常核型11例（31%）、超二倍體12例（34%）、假二倍體9例（26%）、低二倍體3例（9%）。常見染色體數目異常有：伴+21染色體核型9例（26%），伴+8染色體、+19染色體核型各4例（11%），伴+10染色體、+22染色體、-16染色體核型各3例（9%）。有3種以上染色體異常的復雜核型9例（26%）。

29例患兒行RT-PCR檢查顯示，僅EVI1融合基因陽性13例（45%），EVI1合并MLL融合基因、TLS-ERG融合基因各1例（3%）。24例患兒完善與AML相關突變基因檢測，13例患兒結果提示異常，常合并多個基因突變。攜帶ASXL1突變基因10例（41.7%），攜帶WT1突變基因、TET突變基因各5例（20.8%），攜帶TP53突變基因4例（16.7%），其余突變基因有：CEBPA、GATA、JKA2、NRAS、DNMT3A、RUNX1、CTCF、KMT2C、SF3B1基因。

2.3 治療結果

47例患兒中，診斷后23例未接受AML03方案治療，余24例患兒的中位隨訪時間為11.6（0.4～45.0）個月，其中2例中途放棄治療，2例失訪；2例為DS-AMKL患兒，其中1例移植后存活38.0個月，另1例完成化療16.5個月后復發死亡。22例非DS-AMKL患兒行AML03方案（中高危組）化療，2例在誘導緩解Ⅰ階段死亡，未行骨髓細胞學、MRD檢查，誘導Ⅰ、Ⅱ后骨髓細胞學緩解率分別為70%（14/20）、85%（17/20）；3例患兒誘導Ⅰ后未行MRD檢查，1例誘導Ⅱ后未行MRD檢查，誘導Ⅰ、Ⅱ后MRD陰性率分別為41%（7/17）、79%（15/19）。22例非DS-AMKL患兒2年OS率為50%±13%，2年EFS率為40%±12%（圖1）；截至隨訪終點時間，2例失訪，8例復發，復發率為36%（8/22），復發中位時間為9.3（5.9～15.0）個月，其中7例骨髓復發，1例髓外復發；9例患兒死亡，病死率為41%（9/22），其中5例為疾病進展死亡，4例為治療相關死亡。

2.4 預后危險因素

生存分析發現，非DS-AMKL患兒性別、年齡、淋巴結腫大、肝脾大及初診WBC計數對OS率及EFS率的影響差異均無統計學意義（P＞0.05）。患兒行allo-HSCT與單純化療相比，2年OS率和EFS率更低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 AML03方案治療22例非DS-AMKL患兒的生存曲線

表1 22例非DS-AMKL患兒遠期生存的危險因素分析

對細胞免疫分型進行生存分析結果顯示，CD56陽性患兒2年的OS率（P=0.008）和EFS率（P=0.003）低于陰性患兒（表2、圖2）。染色體核型（包括高二倍體、假二倍體、正常核型、伴+21染色體、復雜核型），EVI1融合基因、TET2突變基因、AXSL1突變基因、WT1突變基因對OS率及EFS率影響差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

對早期治療反應情況進行生存分析：誘導Ⅰ后骨髓細胞學及MRD結果對OS率及EFS率影響差異均無統計學意義（P＞0.05）。誘導Ⅱ后骨髓細胞學緩解與未緩解相比，患兒2年OS率（P=0.011）和EFS率（P=0.005）更高；誘導Ⅱ后MRD陰性與陽性相比，患兒2年EFS率（P=0.007）更高。見表3和圖3。

表2 22例非DS-AMKL患兒MICM分型對遠期生存的危險因素分析

表3 22例非DS-AMKL患兒早期治療反應對遠期生存的危險因素分析

圖2 CD56陽性與陰性非DS-AMKL患兒的生存曲線

圖3 誘導Ⅱ后骨髓細胞學及MRD對非DS-AMKL患兒生存曲線的影響

3 討論

兒童AMKL發病年齡多小于3歲，女童稍多，我院AMKL約占AML（除外急性早幼粒細胞白血病）10.1%［13］。臨床以發熱、貧血、出血及肝大為主要表現，淋巴結腫大和脾大比例不高，初診時PLT計數低于其他急性白血病亞型，結果與其他研究報道相似［2-3，10］。AML03方案治療非DS-AMKL結果提示91例患兒3年OS率和EFS率分別為70%±6%、54%±7%［13］，相比之下，AMKL預后稍差。國內有研究結果顯示非DS-AMKL患兒（n=22）治療后2年OS率及EFS率分別僅為36%±13%、22%±11%［14］，國外近幾年研究結果顯示非DS-AMKL患兒OS率可達52.6%～70.0%，EFS率為30.9%～57.0%［2，5，9-11］，提示本研究應用AML03方案治療非DS-AMKL療效接近國際水平。

AMKL患兒可伴骨髓纖維化，導致部分患兒骨髓涂片原始細胞比例不足20%，且部分細胞形態難以辨別，利用MICM分型及其特異性免疫表型標志物協助診斷尤為重要。目前國內外報道伴CD36陽性患兒預后更好［14-15］，本研究顯示CD36陽性與陰性患兒預后無差異。有研究表示AML患兒CD56表達水平高于成人［16］，體外實驗顯示CD56陽性與CBFA2T3-GLIS2融合基因相關［17］，攜帶該融合基因在非DS-AMKL患兒中復發率高、預后差［4，11］。本研究未檢測該融合基因，但CD56陽性患兒OS率及EFS率也明顯低于陰性患兒，提示CD56陽性可能與預后不良相關。

遺傳細胞學對AMKL預后的影響是目前國內外研究熱點，DS患兒患AMKL的風險是非DS患兒的500倍，但預后好［7-8］。本研究中有2例DS-AMKL患兒，占8.3%（2/24），樣本量少未做進一步分析。也有研究報道伴+21染色體核型是非DS-AMKL預后的良好因素［2］，本研究中6例伴+21染色體核型患兒OS率及EFS率卻低于不伴+21染色體核型患兒，但差異無統計學意義，可能由于樣本量少引起結果偏差。

患兒早期的治療反應也與預后效果密切相關，非DS-AMKL患兒骨髓細胞學緩解率較其他AML亞型稍差［2，13，18］。BFM98及BFM04方案結果顯示誘導緩解后骨髓細胞學緩解患兒的預后明顯優于未緩解患兒，其5年OS率分別為66%±6%vs 35%±11%［2］，而本研究中誘導Ⅱ后骨髓細胞學緩解患兒2年EFS率、OS率也明顯高于未緩解組，提示早期治療反應的骨髓細胞學結果與預后密切相關。AML患兒誘導化療后骨髓MRD＜0.1%的預后顯著優于MRD≥0.1%［9，19］，但國外 研究結果未 顯示MRD對非DS-AMKL預后有顯著差異［5］。本研究結果不僅顯示誘導Ⅱ后MRD陰性患兒的OS率及EFS率更好，也為MRD預測遠期預后提供重要依據。

近年來隨著化療方案的優化，CR后行allo-HSCT與單純化療相比，兩者的遠期預后是否存在差異仍有爭議［2，11，14，20］，本研究結果雖顯示OS率及EFS率均無差異，但allo-HSCT的OS率及EFS率更低是由于4例非DS-AMKL移植患兒中，1例復發死亡，1例因感染性休克死亡，分析認為雖然allo-HSCT具有比化療更強的抗白血病潛能，但是治療相關死亡可能部分抵消其療效。這些研究結果受到allo-HSCT樣本量較少的影響，結論有待于進一步證實。

本研究作為回顧性研究，且隨訪時間較短，結果可能存在偏差，未來需進一步行大樣本、多中心、長時間的前瞻性研究，從而才能更加深入對兒童AMKL的認識。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。