丹參飲預處理保護缺血/再灌注損傷模型大鼠心肌細胞實驗研究

任耀龍，楊 磊，趙明君，鄭 剛，徐佳萌，尤金枝，李瑩超

(1.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712021；2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046)

急性心肌梗死是常見的嚴重威脅人類生命安全的心血管系統急危重癥,臨床治療的首要目的在于盡快開通阻塞血管,恢復心肌血流灌注。然而，伴隨而來的心肌缺血/再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)嚴重制約了臨床獲益[1]。目前，認為MIRI與氧化應激[2]、細胞內鈣超載[3]、生理pH值快速恢復[4]、心肌能量代謝障礙[5]、炎癥反應[6]等有關，但其具體病理生理機制尚未明確，且西醫學應對手段較為有限。丹參飲由丹參、檀香、砂仁組成，具有活血祛瘀、行氣止痛等臨床功效，廣泛應用于急性心肌梗死的臨床治療，并顯示出一定的臨床療效。本研究以丹參飲預處理干預大鼠MIRI模型在體心肌細胞，探索中醫經典名方丹參飲對大鼠心肌的保護作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究動物：選擇SPF級健康成年SD大鼠50只，雄性25只，雌性25只，質量180～210 g，購于成都達碩實驗動物有限公司，許可證號[SCXK(川)2015-030]。實驗動物飼養于陜西中醫藥大學協同創新中心SPF級動物實驗中心，給予標準飼料及飲用水喂養7 d后用于實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器：肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB，CK-MB)和N-末端腦鈉肽前體(N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP)試劑盒(批號20191231)，乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase， LDH)試劑盒(批號20191228)。八通道研究型高速記錄系統(澳大利亞埃德公司，型號PL3508/P)、SC-5型小動物呼吸機、全自動酶標儀(美國Bio-Tek公司，型號ELXSOSIU)、高速冷凍離心機(日本日立公司，型號CR22GⅡ)、Leica VT1000 S振動切片機、TC-120S生物組織自動脫水機、TR-180生物組織自動染色、倒置熒光數碼顯微鏡[Nikon公司，型號TS100-F(配DS-5MC)IX73-U]。

1.2 實驗方法

1.2.1 丹參飲：丹參、檀香各15 g，砂仁10 g，實驗藥物均購于陜西中醫藥大學附屬醫院中草藥房。藥物制備：精確稱取生藥40 g，加12倍自來水，浸泡30 min，按藥物質量/水量=1/8量加水煎煮2次(檀香后下)，藥液以1000 r/min，離心10 min除雜質，濃縮為含生藥濃度1 g/ml，4 ℃下密封冷藏備用。

1.2.2 建模、分組及給藥：將實驗動物隨機分為五組：假手術組、模型組、丹參飲低劑量組、丹參飲中劑量組、丹參飲高劑量組，每組10只，每組雌雄各5只。參考實驗動物模型制備文獻[7]并進行改進，具體操作方法如下。大鼠實驗前12 h禁食、不禁水，以10%水合氯醛3.5 ml/kg劑量腹腔注射、實施麻醉后仰位固定于動物解剖臺，正確連接Medlab信號采集系統，監測Ⅱ導聯心電圖，氣管切開行氣管插管接小動物呼吸機(潮氣量2.5 ml，呼吸頻率70次/min，呼吸比1∶2)，觀察穩定5 min后于胸骨左緣約0.5 cm處進行開胸，剪斷第4肋，刺破胸膜充分暴露心臟，剪開心包后將心臟擠出胸腔，于左心耳與肺動脈圓錐交界處高位以0號手術線縫針穿過左前降支(Left anterior descending，LAD)，同時將直徑1 mm的聚乙烯管置于手術線與LAD之間，拉緊手術線使聚乙烯管壓迫LAD造成急性心肌缺血模型，觀察心電圖以ST段抬高大于0.1 mV為結扎成功標志。缺血45 min后去除聚乙烯管恢復LAD灌注，以心臟表面顏色轉紅，抬高的ST段下降1/2以上為再灌注成功標志，再灌注180 min后腹主動脈取血，并快速摘取心臟用于心肌組織樣本檢測。假手術組手術過程與模型組相同，但只穿線不結扎冠脈。假手術組：大鼠給予等體積生理鹽水，2次/d，連續灌服14 d后手術，只穿線不結扎冠脈；模型組：開胸結扎LAD，余同假手術組；丹參飲低劑量組(5 g/kg生藥量)、丹參飲中劑量組(10 g/kg生藥量)、丹參飲高劑量組(15 g/kg生藥量)，各組均配制成10 ml/kg的藥液，2次/d，連續灌服14 d后手術。

1.2.3 心電圖監測：詳細記錄MIRI模型大鼠各階段心電圖表現。

1.2.4 CK-MB、LDH及NT-proBNP水平檢測：再灌注3 h后腹主動脈取血，血液標本3000 r/min離心,取上清分裝，置于-20 ℃冰箱冷凍備用，實驗全部結束后嚴格按照試劑盒操作要求測定LDH、CK-MB和NT-proBNP等生化指標。

1.2.5 心肌梗死面積測定：大鼠心肌梗死面積的測定參照文獻[8]進行，具體操作方法如下。標本采集完成后摘取心臟，以4 ℃生理鹽水充分沖洗后濾紙吸水，分離出完整的左心室后稱定質量；將-20 ℃速凍處理后的左心室沿心尖至基底部切為2 mm厚度的切片，切片后置于濃度為1 %的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrezolium chloride，2,3,5-TTC)中避光孵育10 min，成功染色后心肌梗死區域為蒼白色，具有活性的非梗死區域心肌組織呈暗紅色；將梗死區與非梗死區進行分離后分別稱定質量。以梗死心肌質量與左心室質量的比值代表大鼠心肌梗死范圍。

1.2.6 組織病理學觀察：采血后快速摘除心臟，取缺血心肌組織，置于10%甲醛中進行固定，常規脫水、石蠟包埋、切片，HE染色后作光學觀察，采集圖像進行分析。

2 結 果

2.1 MIRI模型大鼠各階段心電圖表現 本研究詳細記錄了整個實驗過程中各組大鼠心電圖表現。大鼠行前降支結扎后，心電圖表現為ST段呈弓背向上抬高，提示造模成功；45 min后取出聚乙烯管給予前降支再灌注，出現再灌注后室性心律失常，并出現Q波；再灌注180 min后心電圖表現為ST段回落，病理性Q波形成。隨機抽取的1只模型大鼠心電圖表現情況見圖1。

A：造模成功時；B：再灌注時；C：再灌注180 min時

2.2 各組大鼠CK-MB、LDH及NT-proBNP水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平明顯升高，組間差異有統計學意義(均P<0.01)。與模型組比較，丹參飲低劑量組、丹參飲中劑量組、丹參飲高劑量組大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平明顯降低，差異有統計學意義(均P<0.01)，且丹參飲高劑量組降低程度最大，見表1。

表1 各組大鼠CK-MB、LDH及NT-proBNP水平比較

2.3 各組大鼠心肌梗死情況比較 與假手術組比較，模型組大鼠梗死心肌質量、梗死范圍較大，差異有統計學意義(均P<0.01)。與模型組比較，丹參飲低劑量組、丹參飲中劑量組、丹參飲高劑量組大鼠梗死心肌質量、梗死范圍較小，差異有統計學意義(均P<0.01)；與丹參飲低劑量組比較，丹參飲高劑量組大鼠梗死心肌質量、梗死范圍較小，差異有統計學意義(均P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠心肌梗死情況比較

2.4 各組大鼠心肌組織病理學 對大鼠缺血區心肌進行HE染色，觀察各組心肌缺血/再灌注損傷后心肌細胞形態學改變情況。模型組心肌紋理紊亂，心肌細胞正常結構明顯破壞，丹參飲預處理組的病理表現明顯改善，并隨著丹參飲劑量增加，改善效果越明顯(圖2)。

圖2 各組MIRI大鼠心肌組織(HE染色，×20)

3 討 論

冠脈血運重建時代背景下的急性心肌梗死治療以盡早開通病變血管，及時恢復冠脈血流為目標，然而血流恢復后的MIRI進一步增加心肌梗死面積，誘發惡性心律失常，降低心功能，是心血管研究領域尚未解決的科學問題之一。基礎研究表明，MIRI可影響心肌超微結構，導致心肌代謝紊亂、電生理失調及心肌功能異常[9]。目前，西醫學應對MIRI的主要手段包括缺血預處理和缺血后處理，均為有創操作，存在進一步破壞冠脈血管床的潛在風險，臨床應用受限[10-11]。

目前，醫學界對MIRI的具體生理病理機制尚不清楚，認為與細胞凋亡、心肌能量代謝障礙、內皮細胞功能障礙、氧自由基爆發、細胞內鈣超載、中性粒細胞浸潤等有關[12-14]。近年來，中醫藥廣泛應用于MIRI防治領域，現代藥理學證實多種中藥單體及中藥復方可有效減少心肌凋亡、減輕心肌細胞線粒體損傷、調控自噬過程、調節內源性一氧化氮表達、抑制炎癥反應，多角度發揮心肌細胞保護作用[15-17]。袁秋貞等[18]研究結果表明，心肌片能減輕心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細胞凋亡，其機制可能通過激活AMPK信號通路實現。李基赫等[19]研究結果顯示，中藥多糖組分可降低血清及缺血再灌注心肌MDA、SOD、GSH-PX含量，增加心肌Na+K+-ATPase含量，對大鼠心肌缺血再灌注氧化應激反應有一定抑制作用，表明中藥多糖組分對氧化應激反應有一定抑制。丹參飲出自《時方歌括》，由丹參、檀香、砂仁組成，具有活血祛瘀，行氣止痛的功效[20]，是本科研團隊臨床治療急性心肌梗死最常用的經典基礎方劑之一，取得了較滿意的臨床療效。

本研究采用前降支結扎方法制備大鼠MIRI模型，實驗中可見典型的急性心肌梗死心電圖演變過程，部分大鼠在再灌注階段記錄到典型的室性心動過速表現，充分說明造模成功。本研究結果顯示，丹參飲預處理可顯著減低MIRI模型大鼠心肌酶學水平，保護心功能，且高濃度丹參飲保護作用較顯著。在心肌梗死范圍方面，高劑量丹參飲預處理組大鼠心肌梗死范圍最小，進一步表明該方劑預處理可保護心肌細胞。對實驗大鼠缺血區域心肌細胞進行HE染色，從病理學角度直觀說明了丹參飲預處理保護了MIRI模型大鼠心肌細胞的價值。

綜上所述，丹參飲預處理可明顯降低MIRI模型大鼠CK-MB、LDH及NT-proBNP水平，縮小梗死面積，具有顯著的心肌細胞保護作用，且存在一定的量效關系，為臨床防治MIRI提供了新的思路，但其具體作用機制有待進一步研究。