色素上皮衍生因子聯合順鉑對卵巢癌的抑制作用

陳巧玲,白亦光,別 俊,楊 蜜,張家勇

(1川北醫學院第二臨床醫學院,南充市中心醫院腫瘤科,南充 637000;2川北醫學院第二臨床醫學院,南充市中心醫院骨科;*通訊作者,E-mail:baiyiguang@163.com)

卵巢癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤,依據其病理分型可分為上皮癌、惡性生殖細胞腫瘤,嚴重威脅患者生命健康。目前常規治療方式包括手術治療、化學療法、放射療法、靶向治療和免疫治療等[1]。由于腫瘤位居盆腔深處,體積較小,早期難以發現,確診時常常已發展為晚期。手術難以完整切除,需要輔以化療、放療等。

色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是一種分子量為50 kD的內源性糖蛋白,屬于非抑制性絲氨酸蛋白酶抑制劑家族,具有很強的神經分化活性。PEDF在胎兒視網膜上皮細胞條件培養基誘導視網膜母細胞瘤細胞神經元分化的實驗中發現的一種新的神經活性因子[4]。此外,PEDF在腫瘤的表達水平與腫瘤生長和轉移呈負相關[5]。鑒于衰老、血管生成和炎癥反應在腫瘤生長和轉移中的病理作用,補充PEDF蛋白和/或增強內源性PEDF表達可能是治療癌癥的一種新的治療策略。

因此,本研究將聯合PEDF和順鉑在體內外共同干預ID8細胞株以及卵巢癌動物模型,觀察兩種藥物協同治療能否取得良好的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠24只,雌性,8周齡以上,購于川北醫學院實驗動物中心。

1.2 材料和儀器

小鼠卵巢癌ID8細胞(中科院上海細胞庫,中國);RPMI-1640細胞培養液(Sigma);順鉑(DDP,江蘇豪森醫藥公司,中國);胎牛血清(FBS)和胰酶(Thermo公司,美國);細胞凋亡檢測試劑盒(BD公司,美國);酶標儀(Thermo公司,美國);低溫離心機(Eppendorf公司,德國),熒光倒置顯微鏡(Olympas公司,日本)。重組小鼠PEDF蛋白(Abcam公司,英國)。

1.3 小鼠卵巢癌細胞的培養

ID8細胞株用含10%FBS的RPMI-1640完全培養液,置于37 ℃、CO2為5%的培養箱中培養,待細胞呈貼壁生長,匯合度達到80%-90%時,消化傳代培養,采用0.25%的胰蛋白酶消化后傳代。

1.4 細胞增殖能力檢測

CCK-8體外培養ID8細胞,當細胞融合度達到80%時,使用0.25%胰蛋白酶消化細胞,離心,重懸后,以2 000/孔密度接種于96孔板上,在37 ℃,5%CO2濃度的培養箱中培養,24 h后使用含有藥物的完全培養基換液,每個濃度3個副孔,其中三組細胞分別加入100 μl PBS、100 μl PEDF(50 μg/ml)、50 μl PEDF(100 μg/ml)+50 μl DDP(20 μg/ml)培養12,24,36,48 h后,每孔加入10 μl CCK-8,將96孔板放回細胞培養箱孵育2 h,通過Microplate Reader 795酶標儀測450 nm波長處的OD值,并進行數據統計分析。

1.5 細胞遷移能力檢測

收集取生長狀態良好對數生長期的細胞,采用劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力。將ID8細胞接種于6孔板中,5×105個/孔,培養至鋪滿,預冷PBS液沖洗1次,于6孔板細胞上劃痕,預冷PBS液清洗2次,對照組、PEDF組和PEDF+DDP組分別加入1 ml PBS、1 ml PEDF(50 μg)、0.5 ml PEDF(50 μg)+0.5 ml DDP(20 μg),并且每組各加入含10%胎牛血清的1640培育基1 ml,余為對照組,均設2個復孔。分別于0,24 h顯微鏡下觀察并照相,測量記錄劃痕間距離,實驗重復5次,取均值。

1.6 Transwell小室實驗檢測各組細胞侵襲能力

收集取生長狀態良好的對數生長期細胞,將細胞分為對照組、PEDF組和PEDF+DDP組,三組細胞分別加入100 μl PBS、100 μl PEDF(50 μg/ml)、50 μl PEDF(100 μg/ml)+50 μl DDP(20 μg/ml)培養48 h,無血清RPMI-1640培養液重懸細胞,小室置于24孔板,上室加無血清細胞懸液2×105/100 μl,分為3組,各組上室中分別加入100 μl PBS、100 μl PEDF(50 μg/ml)、50 μl PEDF(100 μg/ml)+50 μl DDP(20 μg/ml),下室加1640培養液(含10%FBS)500 μl,37 ℃、50 ml/L CO2飽和濕度培養箱中培養24 h,取出小室,PBS沖洗,用無菌棉簽拭去上層的細胞。40 ml/L甲醛固定30 min,結晶紫染色5 min,在顯微鏡下計數穿透細胞數,選10個視野計算均值,各組重復3次。

1.7 小鼠卵巢癌皮下瘤模型的建立

將濃度為1×106個/ml的ID8細胞于小鼠背部皮下注射皮丘,劑量為0.5 ml。每3 d測量一次腫瘤體積來觀察腫瘤大小,計算公式為:腫瘤體積=腫瘤寬度2×腫瘤的長度×0.52。當小鼠腫瘤體積大約為150 mm3時,用于后續實驗過程。

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1.8 小鼠分組及治療

將24只C57BL/6小鼠隨機分成3組:模型組、PEDF組和PEDF+DDP組,每組各8只。模型組給予100 μl PBS,PEDF組給予靜脈注射12.5 mg/kg PEDF蛋白,PEDF+DDP組給予靜脈注射12.5 mg/kg PEDF蛋白和腹腔注射2 mg/kg順鉑注射液。隔日給藥,共給藥3次。第20天將小鼠處死,剝離腫瘤,進行下一步實驗。腫瘤剝離后放入10%甲醛溶液中固定,進行病理組織學觀察。

1.9 免疫組化染色檢測腫瘤組織CD31表達

腫瘤標本石蠟切片置于3%過氧化氫溶液中,封閉內源性過氧化物酶;PBS緩沖液沖洗,5 min×3次;滴加一抗(CD31蛋白單克隆抗體工作液);置于孵育盒中,恒溫恒濕孵育2 h;PBS緩沖液沖洗,5 min×3次;滴加試劑I(聚合物增強劑);置于孵育盒中,恒溫恒濕孵育20 min;加試劑II(辣根酶標記山羊抗兔/小鼠IgG多聚體);置于孵育盒中,恒溫恒濕孵育30 min;PBS緩沖液沖洗,5 min×3次;將DAB液混勻后滴加至切片,蓋住標本。室溫顯色,在顯微鏡下觀察,蘇木精復染1 min;0.1%HCl分化;PBS沖洗;95%乙醇10 min;95%乙醇2 min;無水乙醇10 min;無水乙醇Ⅱ 2 min;二甲苯Ⅰ 10 min;二甲苯Ⅱ 10 min;中性樹膠封固;顯微鏡下觀察染色情況并采集照片。

1.10 TUNEL染色觀察腫瘤組織細胞凋亡情況

準備好腫瘤標本石蠟切片,脫蠟至水,按照TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒標準步驟進行TUNEL染色,PBS洗滌3次,使用抗熒光淬滅封片液封片后,在熒光顯微鏡下觀察。在5個隨機區域內隨機選擇的視野中的凋亡細胞數量進行定量。避免壞死區干擾,統計凋亡率。

1.11 統計學方法

數值以平均數±標準差表示,采用SPSS24.0統計軟件(IBM,Corp.)進行統計分析。采用采用單因素方差分析及Tukey事后檢驗比較各組間的差異。P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ID8細胞經過不同處理后增殖能力的比較

結果顯示,PEDF組和PEDF+DDP組細胞的OD值在36 h和48 h這兩個時間點明顯低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。與PEDF組相比,PEDF+DDP組細胞的OD值在36 h和48 h這兩個時間點明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖1)。

與control組相比,*P<0.05;與PEDF組相比,#P<0.05圖1 經過不同處理后的ID8細胞增殖能力的比較Figure 1 Comparison of proliferation ability of ID8 cells after different treatments

2.2 ID8細胞經過不同處理后遷移能力的變化

結果顯示24 h時PEDF組和PEDF+DDP組ID8的遷移能力均顯著抑制(P<0.01)。與PEDF組相比,PEDF+DDP組抑制效果更加明顯(P<0.01,見圖2)。

與control組相比,**P<0.01;與PEDF組相比,#P<0.05圖2 經過不同處理后的ID8細胞遷移率的比較Figure 2 Comparison of ID8 cell migration after different treatments

2.3 ID8細胞經過不同處理后的細胞侵襲能力的變化

我們對三組的侵襲細胞數進行分析,結果顯示與對照組相比,24 h時PEDF組和PEDF+DDP組ID8的細胞侵襲能力顯著降低(P<0.01)。與PEDF組相比,PEDF+DDP組的抑制效果更加明顯(P<0.01,見圖3)。

與control組相比,**P<0.01;與PEDF組相比,#P<0.05圖3 經過不同處理后的ID8細胞侵襲能力的比較 (bar=100 μm)Figure 3 Comparison of invasive ability of ID8 cells after different treatments (bar=100 μm)

2.4 小鼠腫瘤體積和小鼠體質量的變化

我們通過每5 d測量1次小鼠皮下腫瘤體積來評價各組藥物對腫瘤的抑制作用。結果顯示,與模型組相比,PEDF組和PEDF+DDP組腫瘤生長均顯著抑制(P<0.05),與PEDF組相比,PEDF+DDP組抑制效果更加明顯(P<0.05)。

我們通過每5 d測量1次小鼠體質量來評價小鼠毒副反應。在實驗過程中,PEDF組、PEDF+DDP組與模型組比較,荷瘤小鼠的體質量變化無明顯差異(P>0.05,見圖4)。同時,各組小鼠的皮毛、食欲、行為等也無特殊改變。表明PEDF組和PEDF+DDP組的給藥劑量對小鼠并不產生明顯的毒副作用。

與control組相比,*P<0.05;與PEDF組相比,#P<0.05圖4 經過不同治療后荷瘤小鼠腫瘤體積和小鼠體質量的比較Figure 4 Comparison of tumor volume and body weight of tumor-bearing mice after different treatments

2.5 腫瘤組織CD31表達的比較

我們對腫瘤標本體外進行病理切片后,進行CD31免疫組織化學染色檢測,CD31表達于細胞膜表面,為內皮細胞的特異性抗原。顯微鏡下觀察結果顯示,模型組CD31表達強陽性,PEDF組和PEDF+DDP組均表現為弱陽性或者陰性表達(P<0.05)。與PEDF組相比,PEDF+DDP組的CD31陽性率表達更低(P<0.01,見圖5)。

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與PEDF組相比,#P<0.05圖5 經過不同治療后腫瘤組織CD31表達的比較 (bar=100 μm)Figure 5 Comparison of CD31 expression in tumor tissues after different treatments (bar=100 μm)

2.6 腫瘤組織中細胞凋亡的比較

在熒光顯微鏡下對三組病理切片進行觀察可以發現:PEDF組和PEDF+DDP組綠色熒光著色的細胞明顯多于模型組,凋亡細胞的數量與模型組比較明顯增加。PEDF+DDP組細胞凋亡率明顯高于模型組和PEDF組(P<0.01或P<0.05,見圖6)。

與control組相比,**P<0.01;與PEDF組相比,#P<0.05圖6 經過不同治療后腫瘤組織中細胞凋亡的比較 (bar=100 μm)Figure 6 Comparison of apoptosis in tumor tissues after different treatments (bar=100 μm)

3 討論

卵巢腫瘤的病死率居婦科惡性腫瘤首位,手術聯合化療使晚期卵巢癌患者的近期生存率有了明顯提高,但治療后患者5年生存率仍為25%-30%[6]。多數卵巢癌患者在治療初始階段對化療較敏感,但是隨著療程的延續逐漸出現獲得性耐藥,所以以鉑類為基礎的化療具有一定的弊端。

PEDF是一個多功能蛋白質,近年來其抗血管生成作用和抗腫瘤作用越來越受到關注。外源性PEDF在肺癌治療作用的研究已取得初步進展,腺病毒載體介導的PEDF基因對小鼠Lewis肺癌的生長具有抑制作用[7]。PEDF不僅能夠抑制腫瘤血管的生成,而且還能直接促進腫瘤細胞的凋亡發揮抗腫瘤作用[8]。PEDF是一種50 kD的分泌型糖蛋白,屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑的絲氨酸蛋白酶超家族,調節與凝血、炎癥、血管生成、蛋白質折疊和運輸等關鍵生物學過程相關的蛋白水解級聯反應[9]。PEDF是一種多功能分子,已知具有心臟保護、分化、神經營養、抗血管生成、抗凋亡和抗腫瘤作用[10],有研究表明,PEDF作為最強的內源性血管生成抑制因子,可以通過增加腫瘤細胞分化、抑制新生血管和抑制癌細胞侵襲和轉移來阻止癌癥進展[11]。本實驗通過使用PEDF蛋白和DDP聯合作用于ID8細胞株以及小鼠卵巢癌模型,觀察兩種藥物協同治療所取得的效果。

本研究中體外研究顯示,PEDF和PEDF+DDP均能顯著抑制ID8的遷移、增殖和侵襲能力,PEDF+DDP抑制效果更加明顯。隨后,我們建立了卵巢癌小鼠模型,通過觀察小鼠腫瘤體積和小鼠體質量的變化評價腫瘤的治療效果和小鼠毒副反應,結果提示荷瘤小鼠的體質量變化無明顯差異,表明藥物的劑量在安全范圍之內。但PEDF組和PEDF+DDP組腫瘤體積較對照組明顯減少,并且PEDF+DDP組的治療效果更佳。為了進一步了解治療效果的機制,我們對腫瘤進行了病理組織學檢測,CD31免疫組織化學染色提示,PEDF組和PEDF+DDP組CD31均表現為弱陽性或者陰性表達,表明藥物的處理明顯抑制了CD31表達。CD31又稱為血小板-內皮細胞黏附分子,分子量為130 kD,其結構屬于免疫球蛋白超家族成員,常表達于內皮細胞間,參與白細胞的遷移、血管生成和整合素的激活。我們在實驗中發現PEDF和PEDF+DDP均有效抑制了CD31表達。TENEL凋亡實驗也顯示了PEDF和PEDF+DDP促進了腫瘤細胞的凋亡,并且PEDF+DDP組的凋亡率更高。

綜上所述,本研究證實了PEDF和DDP的聯合對卵巢癌起到了協同治療作用。不但能夠直接抑制卵巢癌細胞的生長,還可以通過抑制血管內皮細胞的增殖從而抑制新生血管的生成,間接抑制卵巢癌的生長,并促進腫瘤細胞的凋亡。這與PEDF破壞瘤體內的血管網絡以及DDP導致細胞DNA損傷并誘導線粒體凋亡有關。但本實驗還有一些不足,并未在分子蛋白層面探討兩種藥物協同治療的分子機制,并未在逆轉順鉑的耐藥性方面繼續深入探討,這也是本課題組下一步的研究方向。