和厚樸酚對重度燒傷大鼠早期心肌損傷的保護作用及其機制

紀兆樂,秦超師,王芳芳,白寶寶,劉鵬云,周海佳

(空軍軍醫大學唐都醫院心血管內科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:haijiazhouafmu@126.com)

臨床研究發現,在重度燒傷的初始階段即可出現心肌損傷。如果沒有立即進行醫療干預,其損傷將嚴重影響心臟功能,并可能進一步誘發或加重燒傷休克,從而導致患者機體循環功能障礙甚至死亡[1,2]。因此,尋找預防重度燒傷心肌并發癥的有效治療措施已成為當前臨床工作的重點。盡管重度燒傷引起的心肌損傷的確切機制還沒有完全闡明,但越來越多的證據表明,心肌損傷的發生涉及多個病理生理過程,包括缺氧、炎癥、鈣信號傳導、細胞凋亡、敗血癥和氧化應激等[3-5]。

和厚樸酚(honokiol, HKL)是從中藥厚樸中提取的天然酚類活性物質,具有抗血管生成、抗腫瘤、抗菌、抗氧化及抗炎等多重藥理學特性[6]。以往研究表明,和厚樸酚在糖尿病心肌缺血再灌注損傷[7]、膿毒癥及多柔比星心肌損傷[8,9]、病理性心肌肥厚[10]等多種心血管疾病中均表現出了積極的作用,但HKL對重度燒傷所致心肌損傷的影響尚無相關報道。因此,本研究旨在探討HKL對重度燒傷早期心肌損傷的保護作用及其機制是否與減輕氧化應激損傷和炎癥反應有關。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 和厚樸酚(HKL)(Sigma公司,美國);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)ELISA試劑盒(USCN life公司,美國);TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche公司,瑞士);二氫乙錠(dihydroethidium,DHE)活性氧檢測試劑盒(Invitrogen公司,美國);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,中國);抗Nrf2、cleaved Caspase-3抗體(Abcam公司,美國);抗β-actin抗體(北京中杉公司,中國)。

1.1.2 實驗動物 8周齡SPF級雄性SD大鼠40只,體質量200-250 g購自空軍軍醫大學動物實驗中心,動物生產許可證號:SCXK(軍)2007-007號。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立 采用背部燙傷法來構建大鼠重度燒傷模型[11],具體操作流程如下:用戊巴比妥鈉腹腔注射(50 mg/kg)麻醉大鼠后,將大鼠背部剃毛(剃除部分占大鼠30%全身表面積)并將剃毛部位置于100 ℃熱水中浸泡12 s,形成30%全身表面積全層真皮燒傷模型。燒傷后0,6 h分別向腹腔注射乳酸林格液(50 mg/kg)進行液體復蘇。所有大鼠處理后均單籠飼養,燒傷后每隔12 h皮下注射丁丙諾啡(0.25 mg/kg)鎮痛。假燒傷組大鼠除將背部剃毛部位浸入37 ℃溫水中浸泡12 s外,其他處理均與燒傷組相同。

1.2.2 動物分組及處理 將SD大鼠隨機分為4組:假燒傷組(sham)、假燒傷+和厚樸酚處理組(sham+HKL)、燒傷組(burn)、燒傷+和厚樸酚處理組(burn+HKL),每組10只。burn組和burn+HKL組大鼠給予重度燒傷操作,sham組和sham+HKL組大鼠給予假燒傷操作。sham+HKL組和burn+HKL組大鼠分別在背部浸泡后0,6,12 h向腹腔注射5 mg/kg的HKL藥物,sham組和burn組大鼠則在相同時間點給予腹腔注射相同體積的生理鹽水。

1.2.3 心臟功能監測 大鼠左胸前區脫毛,經異氟烷吸入麻醉后,仰臥位固定在操作平臺上,用Vevo 770(VisualSonics公司,加拿大)小動物超聲儀測定大鼠超聲心動圖,記錄左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)以評價大鼠心臟收縮功能,通過舒張期胸骨旁短軸視圖測量二尖瓣E/A比值(E/A ratio)以評價大鼠心臟舒張功能。

1.2.4 心肌組織染色 ①HE染色:將大鼠心臟標本制備成5 μm厚的石蠟切片后脫蠟至水,用蘇木素染細胞核,伊紅染細胞質,再脫水封片,顯微鏡觀察并拍照。②TUNEL染色:按照TUNEL試劑盒說明書對制備好的心臟石蠟切片進行染色,用激光共聚焦顯微鏡對染色好的切片觀察并拍照。每張切片隨機選取5個高倍視野進行盲法觀察。DAPI染色陽性(藍色)計數為一個細胞,與之重疊的綠色點則視為凋亡細胞,凋亡指數以凋亡細胞占總細胞數的百分比來確定。③DHE染色:按照DHE試劑盒說明書對制備好的5 μm厚的心臟冰凍切片進行染色,用激光共聚焦顯微鏡對染色好的切片觀察并拍照。每張切片隨機選取5個高倍視野進行盲法觀察。使用Image-Pro Plus軟件分析切片中的乙錠熒光強度代表各組心肌組織(reactive oxygen species, ROS)生成量。

1.2.5 心肌損傷標志物測定 經大鼠頸總動脈取血并收集至離心管中,待放置于室溫自然凝血后,3 000 r/min離心15 min收集上層血清,用血生化分析儀測定心肌損傷標志物LDH和CK-MB的含量。

1.2.6 心肌炎癥水平測定 如1.2.5方法獲取大鼠血清標本,按照ELISA試劑盒說明書設定反應條件,待反應終止后用酶標儀測定吸光密度值并分別計算各組大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α,黏附分子ICAM-1和VCAM-1的水平。

1.2.7 心肌SOD活性及MDA含量測定 剪取大鼠左心室部分心肌組織,用生理鹽水制備成組織勻漿。嚴格按照試劑盒說明書檢測SOD活性及MDA水平。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達 心肌組織蛋白標品按每孔40 μg進行上樣,采用SDS-PAGE分離膠進行蛋白電泳并通過濕轉法轉移至PVDF膜上。室溫下封閉2 h后,將條帶孵育在Nrf2(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶5 000)的抗體管中,4 ℃過夜。TBST液洗滌3次,再使用辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶4 000)室溫孵育2 h。用ECL化學發光液顯影,通過凝膠成像系統檢測各蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

用Prism 5.0軟件進行統計分析,以均數±標準差表示實驗數據,采用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較組間差異。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 和厚樸酚改善重度燒傷大鼠心臟舒縮功能障礙

超聲心動圖檢測心臟功能結果顯示,與sham組相比,burn組大鼠心臟舒縮功能均顯著受損,表現為LVEF、LVFS值與E/A值均顯著降低(P<0.01),且E/A值<1;給予和厚樸酚處理后,與burn組相比,burn+HKL組大鼠LVEF、LVFS值與E/A值顯著升高(P<0.05),且E/A值>1。與sham組相比,sham+HKL組LVEF、LVFS和E/A值均無明顯差異(P>0.05,見圖1)。可見,和厚樸酚處理可顯著改善重度燒傷大鼠心臟舒縮功能障礙。

與sham組相比,*P<0.05,**P<0.01;與burn組相比,#P<0.05,##P<0.01圖1 和厚樸酚對重度燒傷大鼠心臟功能的影響Figure 1 The effects of honokiol on the cardiac function in severely burned rats

2.2 和厚樸酚減輕重度燒傷大鼠心肌組織損傷

心肌組織HE染色結果顯示,與sham組相比,burn組大鼠心肌細胞水腫,橫紋模糊,部分灶性溶解,心肌纖維出現波浪狀改變,肌束分離;給予和厚樸酚處理后,與burn組相比,burn+HKL組大鼠心肌組織病變程度得到顯著改善,心肌細胞溶解壞死明顯減輕。與sham組相比,sham+HKL組在心肌微觀組織結構改變上無明顯差異(見圖2)。心肌組織損傷標志物檢測結果顯示,與sham組相比,burn組大鼠LDH和CK-MB均顯著升高(P<0.01);給予和厚樸酚處理后,與burn組相比,burn+HKL組大鼠的LDH和CK-MB值顯著降低(P<0.01)。與sham組相比,sham+HKL組血清LDH和CK-MB無明顯差異(P>0.05,見圖2)。可見,和厚樸酚處理可顯著減輕重度燒傷大鼠心肌組織損傷。

與sham組相比,**P<0.01;與burn組相比,##P<0.01圖2 和厚樸酚對重度燒傷大鼠心肌組織結構及血清LDH和CK-MB水平的影響Figure 2 The effects of honokiol on the structure of myocardial tissue and serum LDH and CK-MB levels in severely burned rats

2.3 和厚樸酚抑制重度燒傷大鼠心肌細胞凋亡

心肌組織TUNEL染色檢測細胞凋亡結果顯示,與sham組相比,burn組大鼠心肌細胞凋亡率明顯上升(P<0.01);給予和厚樸酚處理后,與burn組相比,burn+HKL組大鼠心肌細胞凋亡率明顯下降(P<0.01，見圖3)。

與sham組相比,**P<0.01;與burn組相比,##P<0.01圖3 和厚樸酚對重度燒傷大鼠心肌細胞凋亡水平的影響Figure 3 The effects of honokiol on cardiomyocyte apoptosis in severely burned rats

此外,凋亡蛋白cleaved Caspase-3表達結果顯示,與sham組相比,burn組大鼠心肌組織cleaved Caspase-3蛋白表達明顯上升(P<0.01);給予和厚樸酚處理后,與burn組相比,burn+HKL組大鼠心肌組織cleaved Caspase-3蛋白表達被顯著抑制(P<0.01)。與sham組相比,sham+HKL組心肌細胞凋亡率及cleaved Caspase-3的蛋白表達均無明顯差異(P>0.05,見圖3)。可見,和厚樸酚處理可顯著抑制重度燒傷大鼠心肌細胞凋亡。

2.4 和厚樸酚抑制重度燒傷大鼠心肌炎癥反應

血清炎癥因子及黏附分子檢測結果顯示,與sham組相比,burn組大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及黏附分子ICAM-1和VCAM-1的含量均顯著增加(P<0.01);給予和厚樸酚處理后,與burn組相比,burn+HKL組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及ICAM-1和VCAM-1的水平均顯著降低(P<0.05)。與sham組相比,sham+HKL組上述血清炎癥因子及黏附分子的表達無明顯差異(P>0.05,見圖4)。可見,和厚樸酚處理可顯著抑制重度燒傷大鼠心肌組織炎癥反應。

與sham組相比,*P<0.05,**P<0.01;與burn組相比,#P<0.05,##P<0.01圖4 和厚樸酚對重度燒傷大鼠血清炎癥因子及黏附分子水平的影響Figure 4 The effects of honokiol on the serum levels of inflammatory cytokines and adhesion molecules in severely burned rats

2.5 和厚樸酚減輕重度燒傷大鼠心肌組織氧化應激損傷

心肌組織SOD活性及MDA含量檢測結果顯示,與sham組相比,burn組大鼠心肌組織中MDA含量顯著增加,SOD活性顯著下降(P<0.01);給予和厚樸酚處理后,與burn組相比,burn+HKL組大鼠心肌組織中MDA含量明顯降低,SOD活性明顯升高(P<0.01)。此外,心肌組織ROS生成量及抗氧化蛋白Nrf2表達結果顯示,與sham組相比,burn組大鼠心肌組織ROS產量顯著增加,Nrf2蛋白表達量明顯下降(P<0.01);給予和厚樸酚處理后,與burn組相比,burn+HKL組大鼠心肌組織ROS生成量明顯下降,Nrf2蛋白表達量明顯上調(P<0.01)。與sham組相比,sham+HKL組上述氧化應激指標均無明顯差異(P>0.05,圖5)。可見,和厚樸酚處理可顯著減輕重度燒傷大鼠心肌組織氧化應激損傷。

與sham組相比,*P<0.05,**P<0.01;與burn組相比,#P<0.05,##P<0.01圖5 和厚樸酚對重度燒傷大鼠心肌組織氧化應激水平的影響Figure 5 The effects of honokiol on myocardial oxidative stress level in severely burned rats

3 討論

臨床證據顯示,重度燒傷早期階段心肌能量代謝障礙即已發生。由于心臟的特殊重要性,重度燒傷引起的心肌損傷將進一步加重其他組織和器官的缺血性和缺氧性損害,成為導致重度燒傷患者病死率增加的重要因素之一,尤其是在已患有相關心臟疾病的個體中[12,13]。因此,燒傷后給予有效的心肌保護,對改善機體心功能不全,減輕其他組織器官并發損傷和促進患者預后,均具有重要意義。

和厚樸酚是一種含有烯丙基的連苯二酚類化合物,具有多重藥理學作用,是中藥厚樸最主要的兩個活性組分之一,被應用于治療多種消化道疾病[14]。值得注意的是,和厚樸酚的心肌保護效應在近年來受到越來越廣泛的關注。張彬等[7]研究發現,和厚樸酚可通過激活SIRT1/Nrf2信號通路減輕I型糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷。翟蒙恩等[8]觀察到和厚樸酚可通過抑制膿毒癥誘發的心肌氧化應激和凋亡,最終減輕膿毒癥心肌損傷。此外,和厚樸酚還可通過激活線粒體SIRT3信號減輕多柔比星誘發的小鼠心肌損害[9],以及阻斷和逆轉小鼠心肌肥厚[10]。然而和厚樸酚能否緩解重度燒傷引起的心肌損傷尚未見報道。本研究發現,burn組大鼠心臟超聲LVEF、LVFS與E/A值較sham組均顯著降低,HE染色見心肌纖維排列紊亂且心肌細胞溶解明顯,心肌組織損傷標志物LDH和CK-MB活性顯著上升。而和厚樸酚處理可明顯提高重度燒傷大鼠的LVEF、LVFS和E/A值,改善心肌組織微觀結構病理性改變,降低心肌損傷標志物的活性,本研究首次證實了和厚樸酚處理可顯著改善重度燒傷大鼠心臟舒縮功能障礙及心肌組織損傷。

心肌細胞凋亡通常發生在重度燒傷后數小時內,細胞凋亡率的增加會嚴重影響心臟功能[15,16]。抑制心肌細胞凋亡已成為緩解重度燒傷所致心肌損傷的重要一環。Liu等[17]報道,葛根素可通過激活Akt同時抑制p38-MAPK信號抑制心肌細胞凋亡,改善重度燒傷大鼠心功能不全。王長鷹等[18]發現,金絲桃苷可通過激活SIRT1信號通路抑制心肌細胞凋亡,減輕重度燒傷大鼠心肌損傷。本研究結果同樣發現,與sham組相比,burn組大鼠心肌細胞凋亡率及凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表達均明顯上升。給予和厚樸酚處理后可以顯著降低重度燒傷大鼠心肌細胞凋亡率及凋亡蛋白的表達,進一步證實了和厚樸酚抗重度燒傷所致心肌損害的作用。

近年來研究表明,重度燒傷心肌損害程度與心肌組織炎癥反應強度密切相關[2,19]。其中,炎癥因子與黏附分子在炎癥反應中扮演著重要角色。腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素(IL-1β、IL-6)是引起心肌損傷最重要的炎癥因子。一方面,過量炎癥因子之間相互作用產生網絡效應,趨化中性粒細胞進入組織器官。另一方面,大量的中性粒細胞又能釋放過量的炎癥因子,形成惡性循環,從而加重了炎癥反應[20]。而血管細胞黏附分子(VCAM-1)和細胞間黏附分子(ICAM-1)則參與了中性粒細胞黏附心肌細胞并釋放細胞毒素損傷細胞功能的過程,成為引起心肌組織損傷的病理基礎之一[21]。因此,抑制炎癥因子和黏附分子的激活在減輕重度燒傷所致的心肌損傷防治中具有重要價值。本研究結果發現,與sham組相比,burn組大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及黏附分子ICAM-1和VCAM-1的含量均顯著增加。給予和厚樸酚處理后可以顯著降低重度燒傷大鼠心肌上述炎癥因子及黏附分子的表達。以上結果提示和厚樸酚可通過抑制心肌炎癥反應從而發揮抗重度燒傷所致心肌損害的作用。

大量證據表明,氧化應激在燒傷引起的心肌損傷中也起著關鍵作用[2,22]。氧化應激是ROS產生和消除之間不平衡發展的結果。在正常情況下,機體具有有效的抗氧化防御系統,可以對抗過多的ROS的生成。而在重度燒傷等病理情況下,心肌細胞會出現能量代謝障礙,其抗氧化防御能力遭到破壞,繼而生成了過量的ROS,加重了心肌組織氧化應激反應,從而導致心臟結構和功能損傷[23]。此外,MDA作為不飽和脂肪酸過氧化的一種末端代謝產物,被認為是反映氧自由基水平的重要指標。SOD可參與維持細胞氧化還原的平衡,還可以清除氧化應激產生的氧自由基,作為一種重要的抗氧化劑和細胞保護劑。因此,通過檢測MDA和SOD可以間接地反映氧化應激損傷程度[24]。本研究結果發現,與sham組相比,burn組大鼠心肌組織ROS產量顯著增加,抗氧化蛋白Nrf2表達量明顯下降,且心肌組織中MDA含量顯著增加,SOD活性顯著下降。和厚樸酚處理可以顯著減少重度燒傷大鼠心肌組織ROS產量,增加Nrf2的蛋白表達,降低MDA含量及提高SOD活性。以上結果提示和厚樸酚可通過抑制心肌氧化應激反應從而發揮抗重度燒傷所致心肌損害的作用。

氧化應激損傷和炎癥反應均可通過介導心肌細胞凋亡導致心肌損傷。過度增加的ROS可通過刺激脂質過氧化來損傷膜的屏障作用,使膜流動性降低,鈣離子通透性增加,加重細胞內鈣超載和線粒體損傷,誘發細胞色素C等促凋亡因子的釋放[25]。而機體在病理狀態下產生的大量炎癥因子可以募集不同類型的免疫細胞浸潤,影響了心肌局部的免疫微環境。免疫細胞分泌的炎癥介質(基肽、一氧化氮等)同樣也可以破壞膜完整性和酶功能,導致線粒體功能損害及凋亡機制的激活[26]。與此同時,氧化應激和炎癥是緊密相連的。一方面,炎癥因子(如IL-6、TNF-α)可以刺激中性粒細胞產生大量氧自由基;另一方面,氧化應激損傷的脂質過氧化終產物又可以誘導單核-巨噬細胞表達黏附分子、細胞因子、促炎因子及其他炎癥反應的中介物[27]。此外,當大量病理性凋亡出現時,超過鄰近細胞和局部單核巨噬細胞的清除水平,未能被吞噬的凋亡心肌細胞將發生繼發性壞死、崩解,并釋放大量氧化應激與炎性介質,形成損傷與凋亡之間的惡性循環[28]。

綜上所述,和厚樸酚處理可明顯減輕重度燒傷大鼠早期心肌損傷,其機制可能與抑制心肌組織氧化應激與炎癥反應有關。