雷公藤甲素對脂多糖誘導脊髓損傷小鼠及BV2小膠質細胞的調節作用及機制研究

閆 真，王雅玲，高 楓

(延安大學醫學院，陜西 延安 716000)

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是世界范圍內的一個公共衛生問題，神經炎癥在SCI繼發性損傷中起關鍵作用[1-3]。小膠質細胞是中樞神經系統的主要先天免疫細胞，在神經炎癥中發揮著重要作用。小膠質細胞在脊髓損傷反應中被迅速激活，導致多種信號級聯介導的促炎細胞因子上調。而過度的小膠質細胞激活可導致促炎因子如白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和活性氧(ROS)過量產生，從而加重炎癥反應及繼發性損傷[3-7]。

雷公藤甲素(Triptolide，TPL)是一種天然生物活性化合物，最早從中藥雷公藤根中提取分離得到，是雷公藤的主要生物活性成分。TPL具有抗風濕、抗菌、抗炎、免疫調節和抗腫瘤藥理作用，因其對多種疾病的療效而引起研究者廣泛關注，但其臨床潛力仍有待充分發掘[8-10]。目前，細胞移植已成為SCI一種有效治療選擇，其原理側重于減弱小膠質細胞的激活，抑制相關細胞因子的產生，以減少炎癥和SCI[11-13]。我們認為調節由過度活躍的小膠質細胞引起的炎癥障礙可能是一種有前景的SCI治療方法，因此本研究以脂多糖(LPS)刺激的BV2小膠質細胞和SCI小鼠模型為對象，探討TPL對SCI的影響及可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞株 C57小鼠45只，6周齡，體重為100～120 g，購自上海模式生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(滬)2016-0008；常規飼養，給予食物與水分，溫度為20～24 ℃，空氣相對濕度為50%，正常晝夜更替(12 h光照/12 h黑暗)。BV2細胞系購自中國科學院上海生化研究所。

1.2 主要試劑 DMEM培養基；胎牛血清(FBS)；青鏈霉素(15140-122，Gibco)；二甲基亞砜(DMSO)；TPL(645900，Sigma)；LPS(L4391，Sigma)；小鼠TNF-α 酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(E-EL-M0049c，伊萊瑞特)；小鼠IL-6 ELISA 試劑盒(E-EL-M0044c，伊萊瑞特)；小鼠IL-1β ELISA試劑盒(E-EL-M0037c，伊萊瑞特)；一氧化氮(NO)測定試劑盒(A013-2-1，南京建成)；NOD樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)抗體(DF7438，119 kD，Affinity)；IL-1β抗體(abx131988，53 kD，Abbexa)；誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體(AF6270，131 kD，Affinity)；TNF-α抗體(17590-1-AP，26 kD，Proteintech)。

1.3 SCI小鼠模型制備及分組 參考文獻[14]進行SCI小鼠造模(30只)。造模后，15只作為SCI組；對另外15只小鼠連續注射TPL[0.2 mg/(kg·d)] 7 d(TPL組)后，進行HE染色分析、運動康復評估、炎癥因子分析、蛋白檢測等。以正常小鼠為對照組(15只)。

1.4 細胞培養及分組 BV2細胞于含DMEM、10% FBS、1%青鏈霉素的完全培養基中，在培養箱37 ℃、5% CO2條件下培養。待細胞融合度達到80%時隨機分對照組、LPS誘導組和TPL處理組。根據預實驗結果，LPS誘導組采用100 ng/ml LPS處理細胞24 h；TPL處理組先用TPL(50 nmol/L)處理細胞30 min，再加LPS(100 ng/ml)處理24 h。收集細胞或細胞上清進行后續實驗。

1.5 HE染色 小鼠組織脫水后二甲苯透明。透明后的組織塊依次經3缸石蠟(60 ℃)進行浸蠟并包埋，并依次進行切片、烤片并脫蠟。于Mayer氏蘇木素染液中染色5 min，自來水洗浸洗返藍，于1%水溶性伊紅染液中染色5 min，風干后中性樹膠封片、鏡檢。

1.6 運動功能評分(BBB) 術后7 d將三組小鼠放入開口盆中，輕敲盆壁使其爬行，由2名研究人員觀察小鼠臂、膝、踝關節行走、軀干運動及其協調情況并參考文獻[15]進行評分，總分21分，0分為無運動能力，評分高低代表運動能力強弱。

1.7 ELISA檢測 收集SCI組血清或BV2細胞上清，按照ELISA試劑盒操作說明依次加入生物素化抗體工作液、酶結合物工作液、顯色底物、終止液，并于酶標儀上在450 nm波長處測量各孔光密度(OD值)。

1.8 NO檢測 采集小鼠血液或細胞上清，按照說明書依次加入反應液，加樣完成后混勻樣本，靜置10 min，550 nm酶標儀比色，測各孔OD值。NO含量(μmol/L)=(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(100 μmol/L)。

1.9 Western blot檢測 利用RAPI裂解液提取小鼠組織中總蛋白及BV2細胞總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液煮沸制備樣本，電泳分離蛋白樣品并轉膜，孵育對應一抗、二抗，滴加ECL發光液于PVDF膜上反應數分鐘，待熒光帶明顯后用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。晾干膠片，掃描膠片，用Band Scan分析膠片灰度值。

1.10 免疫熒光檢測 固定細胞爬片(4%多聚甲醛)，0.5 % Triton X-100通透15 min后使用封閉液對細胞封閉30 min。一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫避光孵育1 h，滴加一滴封片劑封片后，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結 果

2.1 三組小鼠脊髓組織病理及BBB評分比較 造模7 d后， SCI組脊髓組織結構紊亂和組織排列異常嚴重，經TPL處理后得到明顯改善(圖1A)。同時，TPL組BBB評分優于SCI組(圖1B)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與SCI組比較，#P<0.05

2.2 三組小鼠脊髓組織促炎細胞因子水平比較 見表1。SCI組小鼠脊髓組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平較對照組明顯升高(均P<0.05)。注射TPL(TPL組)可顯著降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平(均P<0.05)。

表1 三組小鼠脊髓組織促炎細胞因子表達水平比較(pg/ml)

2.3 三組小鼠iNOS及NO水平比較 見圖2。SCI組iNOS及NO水平較對照組升高，而TPL組可顯著下調iNOS及NO水平(均P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與SCI組比較，#P<0.05

2.4 三組小鼠NLRP3及IL-1β水平比較 見圖3。SCI可促進NLRP3及其相關蛋白IL-1β的表達，而TPL可顯著抑制這些蛋白的表達。

注：與對照組比較，*P<0.05；與SCI組比較，#P<0.05

2.5 三組BV2細胞促炎細胞因子水平比較 見表2。LPS刺激24 h可加速BV2小膠質細胞IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放，而用TPL孵育后IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯受到抑制。

表2 三組BV2細胞促炎細胞因子水平比較(pg/ml)

2.6 三組BV2細胞NO及iNOS水平比較 LPS處理24 h后BV2細胞中NO水平增加，經TPL處理后NO水平下降(圖4A)。Western blot檢測結果顯示，LPS誘導BV2細胞在蛋白水平上增加iNOS表達，而TPL處理可顯著下調iNOS表達(圖4B、C)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與LPS誘導組比較，#P<0.05

2.7 三組BV2細胞NLRP3及IL-1β水平比較 LPS刺激可促進NLRP3及其相關蛋白IL-1β在BV2小膠質細胞中的表達，TPL則可顯著抑制這些蛋白的表達(圖5A、B)。此外，經過TPL處理的BV2細胞NLRP3在核內熒光強度降低(圖5C)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與LPS誘導組比較，# P<0.05。C圖為免疫熒光染色(×400)

3 討 論

TPL是中藥雷公藤中主要的生物活性化合物，在我國被廣泛用作治療藥物已有數百年歷史[5-7]。雖然TPL在抗炎方面的體內研究取得了相當大的進展，但其在SCI中是否具有抗炎作用及其具體的機制尚不清楚。最近的實驗表明，多種促炎細胞因子，如巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)、IL-1β、IL-6和TNF-α等，在脊髓壓迫損傷后持續升高。抗炎藥物通過M1/M2表型變化調節小膠質細胞極化，減少神經炎癥反應，進而抑制SCI誘導的繼發性組織損傷的產生和擴大[11-12,16-17]。

NO是一種氣體化學信使，是已知的生物活性最小的分子。低濃度NO與中樞神經系統生理過程密切相關，如突觸可塑性、受體功能和神經遞質釋放。在包括SCI在內的病理條件下，NO主要由iNOS合成，在小膠質細胞、星形膠質細胞和血管平滑肌細胞中大量表達。然而，大量NO會導致氧化應激和炎癥反應，形成神經系統疾病[18-19]。NLRP3炎癥小體是研究最廣泛的炎癥小體，其參與無活性Caspase-1前體轉化為活性形式過程。一旦激活，Caspase-1蛋白水解將促炎細胞因子IL-1β前體和IL-18前體轉化為成熟IL-1β和IL-18，這可以驅動一個強大的炎癥級聯反應，最終放大炎癥反應。在嚙齒動物SCI模型中，抑制NLRP3炎癥小體具有顯著的神經保護作用，表明NLRP3炎癥小體是SCI過程中的重要介質。因此，NLRP3炎癥小體可能成為SCI藥物治療的新靶點。此外，NLRP3炎性小體的藥物抑制劑BAY 11-7082或A438079可以促進小鼠SCI模型術后的神經恢復[19-21]。這些發現表明NO分子和NLRP3炎癥小體可能是脊髓損傷治療的靶點。

因此，本研究首先探究了TPL在BV2小膠質細胞中的抗炎作用，結果表明TPL能夠抑制LPS誘導的BV2細胞的炎癥反應，抗炎作用包括減少促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達，同時抑制iNOS表達從而抑制NO釋放。機制分析表明，TPL的抗炎作用可能是通過抑制NLRP3炎性小體表達而實現的。其次，我們探究了TPL對SCI小鼠的作用，發現TPL提高了SCI小鼠的BBB評分，即TPL能有效促進SCI小鼠后肢運動功能的恢復。同時，HE染色觀察脊髓形態學變化發現SCI組小鼠脊髓組織結構紊亂和組織排列異常嚴重，而TPL明顯改善了SCI小鼠脊髓組織學形態。因此，TPL減輕了損傷組織紊亂，改善了術后運動功能。另外，SCI小鼠分子生物學實驗結果與LPS誘導的BV2細胞一致，TPL處理抑制了SCI引起的脊髓組織IL-1β、IL-6、TNF-α高表達，亦可通過抑制iNOS表達進一步抑制NO釋放，并且通過抑制NLRP3炎性小體表達在SCI小鼠中發揮抗炎作用。

綜上所述，TPL可通過抑制NLRP3通路及iNOS-NO通路在BV2小膠質細胞及SCI小鼠模型中發揮抗炎作用，為SCI的治療用藥提供了理論支持。