乙型肝炎病毒S基因不同區域嵌合丙型肝炎病毒中和抗原表位病毒樣顆粒實驗研究

舒 放，王海峰，薛飛肖，呂海港

(1.西北大學附屬醫院 西安市第三醫院檢驗科，陜西 西安 710018；2.西安交通大學附屬紅會醫院麻醉科，陜西 西安 710054)

目前全球丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染者約7100萬人，慢性感染導致肝硬化和肝癌，甚至危及生命。近年來因受感染人口老齡化、口服抗病毒療法廣泛應用等原因，全球HCV流行率快速下降[1]，但某些國家和地區注射毒品流行的增加在某種程度上部分抵消了這一下降，導致新的HCV感染增加[2-5]，僅靠治療仍不足以實現HCV感染的消除。由于獲得治療的機會有限、費用較高、耐藥性、治愈后再感染等情況的存在，迫切需要制定預防HCV感染的有效措施，尤其是研發出廣譜有效的疫苗來阻止全球HCV傳播[6-7]。現有研究[8-10]表明疫苗在機體細胞免疫及體液免疫反應中能夠表現出持久性的抗病毒作用。在控制和預防傳染病方面，疫苗仍然是最具成本效益和最成功的干預措施[11]。病毒樣顆粒(Virus like particle，VLP)是不含病毒遺傳物質顆粒，形態結構與天然病毒相似的能自我裝配的病毒空殼，因此不具備感染性，但具有很強的免疫原性和生物學活性，廣泛應用于疫苗研究領域[12-13]。本研究利用乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)S基因具有裝配VLP的特性，在其親水區和氨基端區插入HCV串聯中和表位抗原，通過定量測定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)比較純化濃縮后的VLP含量，為后期HCV VLP疫苗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 真核載體pCI-neo、重組質粒pCI-HBS、pCI-NEmS、人胚胎腎細胞293T(HEK293T細胞)由唐都醫院韋三華教授惠贈；DMEM培養液、胎牛血清(FBS)購于Gibco;Lipofectamine 2000?轉染試劑購于Invivogen；重組乙型肝炎疫苗購于GlaxoSmithKline Biologicals;Amicon?Ultracell-15 100K離心過濾器購于Millipore;TaqDNA聚合酶、限制性內切酶AgeⅠ購于Thermo公司。

1.2 串聯HCV中和抗原表位合成 根據前期研究選擇了一個 HCV E1 基因區保守的中和表位[ITGHRMAWDMMMNWS(氨基酸序列313～327位)]、兩個E2區具有廣譜交叉活性的中和表位[QLINTNGSWHIN(412～423)和GVPTYSWGENETD(523～535)]以及一個HVR1的模擬表位(ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK)。四者之間用 AAY連接，進行PCR擴增構建串聯多中和表位序列Em，兩端引入AgeⅠ酶切位點ACCGGT。

1.3 串聯HCV中和抗原表位嵌合入HBV S基因親水區 pCI-HBS為親水區aa127～128位引入AgeⅠ酶切位點的重組質粒，酶切體系中加入pCI-HBS 10 μl，10×緩沖液 0 2 μl，AgeⅠ酶2 μl，ddH2O 6 μl，37 ℃ 4 h進行酶切。電泳后回收膠，純化至10 μl。將回收純化的pCI-HBS與Em進行連接，5×緩沖液2 μl，pCI-HBS 2 μl，Em基因5 μl，T4連接酶1 μl，16 ℃過夜。將連接產物轉化DH5α感受態，篩選正確克隆，擴增后提取質粒，送測序后保留插入方向正確的質粒，命名為pCI-S1EmS2。

1.4 制備VLP-NEmS和VLP-S1EmS2 HEK293T細胞培養于含10% FBS的DMEM培養液中(雙抗)。細胞生長至密度80%時，用脂質體法將pCI-S1EmS2和pCI-NEmS轉染至HEK293T細胞，48 h后收集培養上清，2000 r/min離心15 min，除去細胞碎片等雜質，用Amicon?Ultracell-15 100K離心過濾器以4000 g離心15 min，分別命名為VLP-NEmS和VLP-S1EmS2。

1.5 VLP濃縮及純化 將1.4中VLP-NEmS和VLP-S1EmS2分別鋪于9種濃度梯度的蔗糖溶液(20%～60%)上，置于Beckman超速離心機(Rotor SW41)28000 r/min超速離心16 h。從管底依次收集不同濃度層，每個濃度層取10 μl生理鹽水稀釋至200 μl，在羅氏E601電化學發光分析儀上對每個濃度層HBsAg臨界指數(Cut off index，COI)進行測定，收集濃度最高的濃度層。用節流分子量8000～10000的透析袋在20 mmol/L Tris-HCl(8.0)中透析，48 h后將透析好的樣品經0.22 μm濾器除菌，用Amicon?Ultracell-15 100K離心過濾器以4000 g離心15 min，得到純化、濃縮的VLP，-80 ℃凍存。

1.6 VLP定量測定 通過10次獨立實驗重復1.4、1.5實驗步驟，轉染HEK293T細胞后收集培養上清，經過濃縮、純化制備病毒樣顆粒VLP-NEmS以及VLP-S1EmS2。電化學發光法對兩種VLP進行HBsAg定量檢測，VLP-HBS及乙肝疫苗(HBsAg濃度為20×103ng/ml)作為對照。

2 結 果

2.1 HBV S基因及串聯中和表位序列Em擴增產物電泳結果 見圖1。將HBV S基因及串聯多中和表位序列Em擴增產物加樣至1%瓊脂糖凝膠(0.5 μl/ml溴化乙啶)進行電泳，可見681 bp及255 bp擴增片段，與預期相符。

M：DNA Marker 2000；1：HBV S基因擴增產物；2：串聯中和表位序列Em擴增產物

2.2 VLP-NEmS和VLP-S1EmS2蔗糖密度梯度離心結果 見圖2。分別收集1 ml/管的9層分離片段進行HBsAg定量測定，結果在6號濃度(即45%濃度)蔗糖溶液中收集到的2種VLP濃度最高。

注：1～9號分別代表質量體積百分比濃度為20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%蔗糖溶液

2.3 透析、濃縮后VLP濃度比較 見圖3。重復轉染、純化、濃縮制備VLP的過程，對10次獨立實驗的均值結果進行統計學分析。VLP-NEmS、VLP-S1EmS2和非嵌合重組質粒轉染的VLP-HBS HBsAg均值分別為(5.83±0.53)×103ng/ml、(1.81±0.76)×103ng/ml和(6.27±0.47)×103ng/ml，其中VLP-S1EmS2低于VLP-HBS(t=16.83，P<0.05)，而VLP-NEmS與VLP-HBS均值比較差異無統計學意義(t=1.542，P=0.157)。因此，HCV串聯中和抗原表位嵌合于HBV S基因氨基端胞外區形成的病毒樣顆粒包裝效率高于親水區。

注：與VLP-HBS比較，*P<0.05

3 討 論

傳統的疫苗研究直到20世紀80年代仍主要基于減毒或滅活病毒，在誘導宿主產生有效T細胞及B細胞免疫應答中顯示出良好功效，并能產生持久的免疫力[14]。主要歸因于減毒病毒應答能力、表面幾何形態重復性、顆粒特性、刺激產生先天性和適應性免疫反應能力等幾個關鍵特性[15]，但是傳統疫苗在生產效能及對免疫缺陷患者安全性方面有其自身缺陷，因此人們需要尋找新的疫苗研發替代方案。

VLP疫苗具有大多數傳統疫苗的特性，由于缺少病毒基因組而無法復制，因此作為疫苗開發的安全性得以保證。大多數VLP外殼由幾個相同蛋白質拷貝構成，形成二十面體或螺旋(棒狀)結構[16]。絕大多數VLP直徑在20～100 nm，這使得其能夠自由進入淋巴管到達被膜下淋巴結并選擇性地被抗原提呈細胞所攝取[17]。許多病毒結構蛋白都具有自主組裝成VLP的能力。VLP可以在170多種不同表達宿主系統中產生，包括細菌、昆蟲、酵母或哺乳動物細胞以及植物細胞，某種程度上反映了VLP宿主譜的廣泛性。HBV S基因在沒有核心蛋白和基因組的參與下能夠自我裝配，在宿主細胞中產生VLP并分泌至培養上清中，因其可以攜帶外源性蛋白，易于制備及純化，能增強外源性蛋白免疫原性，是公認的較好表達載體。使用異源表達系統甚至可以獲得三聚體的復雜表位，如人類免疫缺陷病毒(HIV-1型)包膜糖蛋白[18]和流感病毒血凝素[19]的三聚體。

我們根據之前的研究，選取3個HCV抗原表位基因進行串聯，分別嵌合于HBV S基因親水區及氨基端胞外區，構建串聯嵌合基因的重組表達載體質粒，轉染293T細胞，在培養液上清中分別收集VLP。經過濃縮及純化，以定量測定HBsAg的方法比較各種VLP濃度，反映HBV S基因不同區域嵌合HCV中和抗原表位表達載體生成VLP的效率。在之前的研究[20]中，我們將不同片段HCV抗原表位分別嵌合在HBV S基因親水區同一位置，并對其VLP形成情況進行分析，經濃縮、純化后，幾種VLP能夠與商品化的乙肝疫苗在HBsAg含量上達到同一數量級，但由于插入片段表位性質及長短不同，收集的幾種VLP相比其濃度存在差異，主要表現為HBV S基因親水區插入的HCV表位序列越長，形成VLP的能力越弱。但理論上嵌合的HCV表位越長，涉及的抗原譜越廣，疫苗產生的有效應答概率越大，所以在質和量上產生了矛盾。為了驗證插入表位氨基酸數量及位置對包裝VLP的影響，我們將3種HCV表位串聯形成較長的片段，分別嵌合在HBV S基因親水區及氨基端胞外區，構建表達載體PCI-NEmS與PCI-S1EmS2，用脂質體法轉染293T細胞，在細胞培養上清中收集嵌合病毒樣顆粒VLP-NEmS與VLP-S1EmS2，經過多輪重復實驗分析嵌合方式對于VLP形成的影響。從HBsAg含量測定結果來看，胞外區嵌合VLP-NEmS與親水區VLP-S1EmS2濃度結果有統計學差異，胞外區含量較高。

綜上所述，HCV中和表位嵌合位置不同造成病毒樣顆粒的包裝能力差異，嵌合于胞外區氨基端比嵌合于親水區能夠更有效率地包裝出病毒樣顆粒，成為疫苗研發中可以參考的一種策略。本實驗制備的VLP與商品化的乙肝疫苗達到相同數量級，能夠滿足后續HCV體外培養系統及免疫動物評價中和抗體的實驗要求，為誘導廣譜交叉保護作用中和抗體的HCV疫苗研究奠定了基礎。然而，本研究雖然證明HCV串聯中和表位嵌合在HBV S基因氨基端胞外區比親水區包裝出的VLP效率高，但嵌合于HBV S基因不同部位是否能夠刺激機體產生相同、有效的中和抗體水平以及交叉保護作用仍需要通過動物模型及中和抗體評價系統做進一步的研究。