基于網(wǎng)絡(luò)藥理及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)人參治療非小細(xì)胞肺癌作用機(jī)制研究

邸金娜，劉敬禹，張 莉

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

肺癌大多起源于支氣管黏膜上皮，也稱支氣管肺癌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年全球有1810萬(wàn)新增癌癥患者，我國(guó)癌癥患者約380.4萬(wàn)例，其中肺癌發(fā)病率為11.8%，病死率為18.4%[1]。而非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung cancer，NSCLC)可占所有肺癌病例的83%，其5年相對(duì)生存率僅為18%[2-3]。近年來(lái)中藥在預(yù)防及治療NSCLC上顯現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，并逐漸受到研究者的重視。人參作為常用的中藥材，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺等功效，臨床上應(yīng)用廣泛。大量研究[4-6]表明，人參可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞分化等達(dá)到治療NSCLC的目的。但因人參成分復(fù)雜，對(duì)于其治療NSCLC的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制，目前仍不明確?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，本研究構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病-通路”蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)人參治療NSCLC核心靶點(diǎn)及機(jī)制，為人參治療NSCLC提供參考。

1 資料與方法

1.1 人參活性成分收集 以“人參”為檢索詞，從中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)對(duì)所有藥物成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選和構(gòu)建。篩選條件：口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18[7]。搜索中醫(yī)藥整合藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算研究平臺(tái)(TCMIP，http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php)整合藥物潛在活性成分和相應(yīng)靶標(biāo)信息，獲得人參活性成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape軟件，建立人參-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2 NSCLC-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用比較毒物遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(CTD，http://ctd.mdibl.org)、基因名片數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Cards，https://www.genecards.org)和療效藥靶數(shù)據(jù)庫(kù)(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)，以關(guān)鍵詞“non-small-cell carcinoma”檢索獲取NSCLC基因。通過(guò)Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將人參和NSCLC基因進(jìn)行整合，選取交集基因?qū)隒ytoscape軟件建立NSCLC-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.3 人參-靶點(diǎn)-NSCLC PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cyto NCA插件對(duì)交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析[8]，建立人參-靶點(diǎn)-NSCLC PPI網(wǎng)絡(luò)。保存PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件，根據(jù)Degree值中位數(shù)篩選核心靶點(diǎn)。

1.4 基因富集分析 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(GO)注釋和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。以P≤0.01為限定條件，從基因生物功能和信號(hào)通路角度進(jìn)一步明確人參對(duì)NSCLC的作用機(jī)制。

1.5 分子對(duì)接模擬 利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)輸入相關(guān)蛋白質(zhì)名字，并下載mol2格式靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)文件，通過(guò)軟件Auto Dock Tools1.5.6調(diào)整X、Y、Z坐標(biāo)并進(jìn)行分子對(duì)接模擬。對(duì)接完成后用DS軟件顯示對(duì)接后作用力。若對(duì)接評(píng)分<4.25，則分子和靶點(diǎn)親和力不強(qiáng)；>4.25，則有中等親和力；>5，則有較強(qiáng)親和力；>7，則有強(qiáng)烈親和力[9]。

2 結(jié) 果

2.1 人參-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò) 見(jiàn)圖1。根據(jù)TCMSP共篩選出22個(gè)人參成分，其中馬爾肯久納醇(Malkangunin)、五味子酯乙(Gomisin B)、菊黃質(zhì)(Chrysanthemaxanthin)、苯代南蛇堿(Celabenzine)成分無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白，進(jìn)一步檢索人參18個(gè)成分作用靶點(diǎn)共118個(gè)。將人參成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，生成人參成分-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。

圖1 人參成分-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.2 NSCLC-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)TTD篩選出22348個(gè)NSCLC靶點(diǎn)蛋白，通過(guò)Gene Cards和CTD分別篩選得到4180個(gè)和148個(gè)靶點(diǎn)蛋白，進(jìn)一步利用Veen篩選出79個(gè)共有靶點(diǎn)，并利用Cytoscape軟件生成NSCLC-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示與NSCLC相關(guān)節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)3675個(gè)，邊緣蛋白質(zhì)85921個(gè)。

2.3 篩選核心靶點(diǎn) 建立“人參成分-靶點(diǎn)-NSCLC”PPI交集網(wǎng)絡(luò)(圖2)，最終可以得到93個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白。分析PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)Degree值，最大值為12，中位數(shù)為2。將靶點(diǎn)篩選條件范圍設(shè)置為4～12，篩選得到26個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白。

圖2 人參-靶點(diǎn)-NSCLC PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO注釋分析和KEGG通路分析 GO注釋分析結(jié)果顯示有9個(gè)基因有注釋數(shù)據(jù)，42個(gè)生物過(guò)程中有富集，其中符合P≤0.01的生物過(guò)程有12個(gè)。KEGG通路分析結(jié)果顯示有26個(gè)基因有注釋數(shù)據(jù)，56條通路有富集，其中符合P≤0.01的信號(hào)通路有35條。GO注釋分析和KEGG通路分析共同富集結(jié)果有細(xì)胞周期(Cyclin)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)通路、鼠雙微體(MDM)2/4信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路等。

2.5 人參成分與NSCLC靶點(diǎn)模擬對(duì)接結(jié)果 見(jiàn)圖3。人參成分與PIK3CG、CDK2、EGFR、MET等成分具有較強(qiáng)親和力。通過(guò)DS軟件分析發(fā)現(xiàn)，人參成分與以上靶點(diǎn)均可形成H鍵及疏水作用，其中人參成分中西托糖苷(Alexandrin)、灌木遠(yuǎn)志酮 A (Frutinone A)、原阿片堿(Fumarine)等成分評(píng)分均優(yōu)于EGFR抑制藥奧希替尼(對(duì)接評(píng)分=8)和MET抑制藥克唑替尼(對(duì)接評(píng)分=8)。分子對(duì)接結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)篩選結(jié)果一致，且人參活性成分與陽(yáng)性藥奧希替尼和克唑替尼相比，分子對(duì)接吻合度比上市的陽(yáng)性藥物效果更好。

圖3 人參成分與NSCLC靶點(diǎn)對(duì)接評(píng)分

3 討 論

本研究通過(guò)TCMSP篩選人參有效活性成分，顯示人參有380種成分，其中滿足條件的有鄰苯二甲酸二異辛酯(Diop)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)等22個(gè)成分，進(jìn)一步篩選出各成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)共118個(gè)，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。再利用TTD、GAD、Gene Cards篩選出79個(gè)NSCLC作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建疾病-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)將兩個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)整合建立成分-靶點(diǎn)-疾病PPI網(wǎng)絡(luò)，其中CDK2、EGFR、MDM2等26個(gè)靶點(diǎn)的Degree值較高，確定為人參治療NSCLC潛在核心靶點(diǎn)。通過(guò)富集分析發(fā)現(xiàn)，人參成分可通過(guò)干預(yù)細(xì)胞周期、EGFR信號(hào)通路、MDM2/4信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等發(fā)揮治療NSCLC的潛在作用。

人參中的灌木遠(yuǎn)志酮 A(Frutinone A)、原阿片堿(Fumarine)、吉九里香堿(Girinimbin)、高麗槐素(Inermin)、蘇齊內(nèi)酯(suchilactone)均可與靶蛋白EGFR、原癌基因蛋白質(zhì)(MET)顯現(xiàn)出良好的分子對(duì)接活性，9種活性成分和EGFR靶蛋白的對(duì)接區(qū)域與內(nèi)源性配體結(jié)合位置基本相同，因此可能起到和內(nèi)源性配體相同的作用，且人參活性成分與陽(yáng)性藥奧希替尼和克唑替尼相比，分子對(duì)接吻合度比上市的陽(yáng)性藥物效果更好。研究[10-12]表明，EGFR基因突變發(fā)生于39%～81%的NSCLC患者，與癌胚抗原基本一致。EGFR屬于受體酪氨酸激酶(RTK)的ErbB家族，EGFR突變可持續(xù)激活下游通路，促進(jìn)增殖、存活、侵襲和血管生成[13]。而PI3K-AKT通路是EGFR的主要下游信號(hào)通路之一，當(dāng)EGFR發(fā)生突變時(shí)，PI3K-AKT通路被持續(xù)激活，加速NSCLC的進(jìn)展[14]。有研究[15-16]表明，EGFR基因突變還能通過(guò)激活下游MAPK信號(hào)通路上調(diào)程序性死亡受體-1(PD-1)、程序性死亡受體-配體1(PD-L1)和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原4蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生免疫逃逸。此外，EGFR調(diào)控的信號(hào)通路還有FoxO、PLC-g以及RAS-RAF-MEK等[16-18]。

MDM2/4基因在NSCLC發(fā)生及發(fā)展中越來(lái)越被重視，是最為重要的負(fù)性調(diào)控因子。如果改變MDM2/4蛋白水平，MDM2/4和p53之間的平衡就會(huì)受到破壞[19]。p53作為一種編碼的核磷蛋白，被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞中一種重要的腫瘤抑制因子[20-21]，人參中β-谷甾醇、苯代南蛇堿(Celabenzine)、原阿片堿、人參皂苷Rg5(Ginsenoside Rg5)MDM2/4蛋白具有較強(qiáng)的親和力，因此以上活性成分可通過(guò)調(diào)控MDM2/4蛋白來(lái)控制p53水平，從而達(dá)到治療NSCLC的目的。

除EGFR、MET、MDM2/4外，人參治療NSCLC的作用機(jī)制還可能是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂、抑制PI3K-AKT信號(hào)通路激活、參與cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程影響腫瘤基因的表達(dá)，充分體現(xiàn)出了人參治療NSCLC具有多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。盡管有這些重要發(fā)現(xiàn)，本研究仍存在許多局限性：首先，由于信息不完整，可能忽略了某些化合物在NSCLC中的作用。其次，我們還未進(jìn)行臨床研究和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，具體機(jī)制尚不清楚，需要在臨床實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步分析。因此，有必要進(jìn)一步研究人參重要的單一組分在病理過(guò)程和特定靶標(biāo)中的功能。