慢性乙型肝炎患者Toll樣受體2與乙型肝炎病毒DNA表達水平相關性研究

楊麗娟，郝小康，周 軍

(1.安康市人民醫(yī)院檢驗科，陜西 安康 725000；2.西藏民族大學附屬醫(yī)院檢驗科，陜西 咸陽 712082)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是導致慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)發(fā)生的根本性原因，也是全球性公共衛(wèi)生問題[1]。我國約有HBV攜帶者9300萬例，其中CHB患者2000萬例，是肝硬化、肝功能失代償、肝癌發(fā)生的主要危險因素，早期診治可及時阻斷病情，改善患者預后[2-3]。特別是很多CHB患者機體免疫功能低下，不能產(chǎn)生有效的針對HBV的特異性細胞毒T淋巴細胞反應，使HBV得以不斷復制增殖，導致HBV感染持續(xù)化，形成惡性循環(huán)[4-5]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是在機體免疫性發(fā)揮重要作用的一類模式識別受體(PRR)家族分子，具有高度保守的分子結構，可被非特異性免疫細胞識別[6-7]。在病毒性肝炎中，TLRs與配體結合后可經(jīng)胞內信號轉導途徑激活核轉錄因子的表達，誘導特異性靶細胞基因的表達，從而抑制機體的病毒復制，介導修復機體的肝損傷[8-10]。本研究探討CHB患者HBV-DNA水平與TLR2表達的相關性，以明確CHB發(fā)生機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年8月到2020年10月在本院診治的CHB患者123例作為肝炎組，選擇同期的健康體檢者123例作為對照組。兩組一般資料對比無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)，見表1。肝炎組納入標準：均符合CHB診斷標準，病程≥6個月；HBV-DNA檢測陽性；年齡25～75歲；患者均知情同意并簽署同意書。排除標準：妊娠與哺乳期婦女；藥物、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎及其他病毒性肝炎感染者；不能合作者；臨床資料缺乏者；嚴重心、肺、腦、腎等重要臟器功能障礙者。

表1 兩組一般資料對比

1.2 HBV-DNA水平與TLR2相對表達檢測 抽取所有入選者空腹靜脈血2～3 ml，肝素鈉抗凝30 min，3000 r/min離心15 min。取全血組織提取淋巴細胞，分離單個核細胞。提取總RNA后逆轉錄為cDNA，進行熒光定量PCR擴增，PCR條件：94 ℃ 2 min，然后94 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20s持續(xù)40個循環(huán)，40 ℃ 10 s。TLR2正向引物為5’-GGGAACATCCAAGGCAAG-3’，反向引物為5’-AGCTCATCTAGCACCTCACT-3’。同時檢測HBV-DNA水平。

1.3 肝功能指標檢測與病理分級 調查所有入選者一般資料，記錄肝功能指標[谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)、γ-谷氨酰轉移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)等]水平。對肝炎組患者進行肝臟炎癥病理分級：①匯管區(qū)及周圍無炎癥，小葉內無炎癥，為G0級；②匯管區(qū)及周圍炎癥，小葉內變性及少數(shù)點狀壞死，為G1級；③匯管區(qū)及周圍輕度碎屑樣壞死，小葉內可見嗜酸小體，為G2級；④匯管區(qū)及周圍中度碎屑樣壞死，小葉內可見變性、融合壞死，為G3級；⑤匯管區(qū)及周圍重度碎屑樣壞死，累及多小葉壞死，為G4級。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.00統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，對比采用t檢驗。計數(shù)資料對比采用卡方檢驗。相關性分析應用Pearson法。影響CHB患者HBV-DNA水平的因素采用Logistic回歸分析。P<0.05認為具有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 兩組HBV-DNA與TLR2相對表達水平比較 對照組未檢出HBV-DNA，肝炎組HBV-DNA<103IU/ml 45例，103～106IU/ml 55例，>106IU/ml 23例。肝炎組TLR2相對表達水平高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組TLR2相對表達水平比較

2.2 肝炎組患者炎癥病理分級 在肝炎組炎癥病理分級中，G0級56例，G1級24例，G2級20例，G3級13例，G4級10例。

2.3 兩組常規(guī)肝功能指標比較 見表3。肝炎組血清ALT、AST、AFP、GGT與ALP高于對照組(均P<0.05)。

表3 兩組常規(guī)肝功能指標比較

2.4 CHB患者HBV-DNA與TLR2等指標相關性分析 見表4。Pearson相關性分析結果顯示，HBV-DNA水平與TLR2、ALT、AST、AFP、肝臟炎癥病理分級、ALP存在相關性(均P<0.05)。

表4 CHB患者HBV-DNA與TLR2等指標相關性

2.5 CHB患者HBV-DNA水平影響因素分析 見表5。在123例患者中，以HBV-DNA水平作為因變量，以TLR2、ALT、AST、AFP、肝臟炎癥病理分級作為自變量，進行Logistic回歸分析，結果顯示TLR2、ALT、AST、AFP、肝臟炎癥病理分級均為CHB患者HBV-DNA水平的影響因素(均P<0.05)。

表5 CHB患者HBV-DNA水平影響因素分析

3 討 論

CHB為臨床上比較常見的傳染性疾病，是肝細胞癌、肝硬化、肝功能失代償發(fā)生的重要病因[11]。其具體發(fā)生機制，目前還不明確，一些學者認為宿主免疫系統(tǒng)與HBV-DNA相互作用是重要原因，特別是體內HBV-DNA的感染與清除以及相關肝臟損傷情況往往取決于機體的免疫狀態(tài)[12-13]。本研究顯示對照組未檢出HBV-DNA，肝炎組均檢出HBV-DNA，且肝炎組TLR2相對表達水平也高于對照組。TLR在觸發(fā)先天免疫抗病毒過程中起關鍵作用，HBV-DNA反過來也可以通過抑制TLR等激活而抑制宿主防御，抵抗機體對病毒的清除[14]。TLR2屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質區(qū)組成[15]。胞質區(qū)為Toll/白細胞介素-1受體(TIR)結構域，跨膜區(qū)是富含半胱氨酸的區(qū)域，胞外區(qū)是由串聯(lián)的富含亮氨酸的重復基序形成的亮氨酸結構域[16]。胞質區(qū)與白介素-1受體家族高度同源，負責與細胞內含有TIR結構域的接頭蛋白分子相互作用，調節(jié)下游信號級聯(lián)反應[17]。TLR2主要分布于細胞膜上，可以識別胞質中的雙鏈RNA(dsRNA)，再通過銜接蛋白啟動特異性信號通路，從而激活促炎癥細胞因子基因，介導抗病毒效應。相關研究顯示，巨噬細胞上TLR2下游通路可以被HBV-DNA干擾，導致炎癥因子分泌受到抑制，從而使抗病毒免疫能力受到影響。TLR2不僅在肝炎和肝纖維化時表達水平升高，而且在肝癌組織中也有持續(xù)表達[18]。下調或沉默TLR2則可明顯降低化學誘導肝炎的發(fā)生率，上調TLR2可促進相關炎癥因子等的釋放[19]。

CHB的發(fā)生是一個復雜過程，涉及許多腫瘤標志物與基因在不同節(jié)點的表達[20]。本研究顯示肝炎組血清ALT、AST、AFP、GGT與ALP值高于對照組，不過這些指標的特異性不強，很難單獨反映CHB病情進展情況，為此在臨床上還需要尋找能夠完全滿足臨床診斷的可靠標記物。

細胞免疫應答(包括輔助T細胞和細胞毒T細胞應答)在機體清除HBV-DNA過程中起重要作用[21]。TLR2能識別dsRNA，活化MyD88非依賴信號通路，激活促炎癥因子及Ⅰ型干擾素基因轉錄，介導抗病毒效應[22]。本研究Pearson相關性分析顯示CHB患者HBV-DNA水平與TLR2、ALT、AST、AFP、肝臟炎癥病理分級、ALP均存在相關性；Logistic回歸分析顯示TLR2、ALT、AST、AFP、肝臟炎癥病理分級均為CHB患者HBV-DNA水平的影響因素。TLR2可調控先天和獲得性免疫，在HBV感染及繼發(fā)肝臟炎癥損傷過程中起著至關重要的作用。

綜上所述，CHB患者多伴有TLR2高表達，與HBV-DNA水平呈正相關，是影響CHB患者病情與肝功能的重要指標。但限于患者數(shù)量少及收集時間較短等原因，本研究可能存在一定偏倚，后續(xù)將進行更為深入的研究。