α-淀粉抑制酶納米脂質體運動食品的制備及穩(wěn)定性評價

符宇蘭

（上海電子信息職業(yè)技術學院，上海 201199）

隨著生活條件的提高，人們的飲食也越來越豐富，肥胖問題愈發(fā)嚴重，其中過多碳水化合物的攝入，是導致肥胖的主要“元兇”。市場上的減肥產品種類繁多，但質量良莠不齊[1-2]，且很多對身體的傷害很大。α-淀粉抑制酶是一種淀粉酶的抑制劑，能與α-淀粉酶分子上的相應部位結合并引起分子構象改變，使其失去活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，讓其直接排出體外，減少其消化吸收從而達到減肥的功效[3-4]。但α-淀粉抑制酶穩(wěn)定性較差，經(jīng)過食品加工或人類消化極易喪失活性。研究開發(fā)高載量、高穩(wěn)定性的α-淀粉抑制酶包埋技術是解決上述問題的關鍵。

納米脂質載體是一種新型功能性食品載體，在食品工業(yè)中用于包埋具有功能性食品成分的物質，一般是由固態(tài)脂和液態(tài)脂混合熔融，然后冷卻生成大量的非完美晶格而得到[5-6]。與其他包埋技術相比，納米脂質載體技術具有高載量、高物理穩(wěn)定性以及很好的生物相容性，特別是對于α-淀粉抑制酶等穩(wěn)定性較差的功能性成分，是一種極具發(fā)展前景的新型脂質包埋技術[7-10]。本研究通過納米脂質體的方式對α-淀粉抑制酶進行物理改性和包埋，使其具有促進抗消化、易吸收的特性，可以提高α-淀粉抑制酶在腸道中的存在狀態(tài)，幫助食用者降低對淀粉的利用[11]，從而達到降低體重且不會影響身體的各項指標的目的，具有運動功能食品的功效。所以這種納米脂質運動功能食品的研發(fā)具有一定意義，其既符合現(xiàn)代消費者的消費需求，也符合當今運動功能性食品的發(fā)展方向，有利于運動健康產業(yè)的發(fā)展。

本研究以α-淀粉抑制酶為主要原料，以包封率為指標[12]，通過卵磷脂和膽固醇以一定質量濃度合成納米脂質體[13-14]，生產出一款具有運動功能性的α-淀粉抑制酶納米脂質體食品。并對α-淀粉抑制酶添加量、卵磷脂添加量、膽固醇添加量、攪拌溫度等4個因素進行單因素實驗，在此基礎上進行正交試驗[15-18]，選擇較合適的工藝條件。試驗還研究了貯藏條件對α-淀粉抑制酶的納米脂質體穩(wěn)定性的影響，為這款運動功能性食品的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-淀粉抑制酶（純度98%，白蕓豆提取，食用級）

上海藍基生物科技有限公司；膽固醇（純度95%）、卵磷脂（純度98%） 上海太偉藥業(yè)有限公司；95%無水乙醇、石油醚（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

Nano-Zs90粒徑分析儀 德國新帕泰克有限公司；LD5-10B大容量離心機 湖南湘儀有限公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；MC-128電熱恒溫水浴鍋 寧波實驗儀器廠；Bilon-09均質機 無錫市科爾儀器設備有限公司；R611超高溫瞬時滅菌儀 蘇州得科機械設備有限公司；SFSA微濾設備 杭州珀瑞分離技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1α-淀粉抑制酶納米脂質體的制備 稱取一定量的α-淀粉抑制酶溶解于50 mL、pH6.5、0.05 mol/mL的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液（PBS）中。另稱取一定質量濃度的卵磷脂和膽固醇溶解于無水乙醇中。用注射器將上述脂質乙醇溶液快速注入溶有α-淀粉抑制酶的PBS緩沖液中，在一定溫度下攪拌30 min，得到α-淀粉抑制酶納米脂質體懸浮液。將懸浮液移入250 mL圓底燒瓶內，溫度50 ℃，時間30 min，將懸浮液中的乙醇揮干，即得到α-淀粉抑制酶納米脂質體。

1.2.2 單因素實驗 本試驗分別考察α-淀粉抑制酶添加量、膽固醇添加量、卵磷脂添加量以及攪拌溫度等4個因素對該納米脂質體的包封率影響。

α-淀粉抑制酶添加量對納米脂質體包封率的影響：固定膽固醇添加量為6 mg/mL、卵磷脂添加量為0.15 mg/mL、攪拌溫度為50 ℃，分別考察α-淀粉抑制酶添加量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL時，納米脂質體的包封率。

膽固醇添加量對納米脂質體包封率的影響：固定α-淀粉抑制酶的添加量為2.0 mg/mL、卵磷脂添加量0.15 mg/mL、攪拌溫度為50 ℃時，考察膽固醇添加量為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 mg/mL時，納米脂質體的包封率。

卵磷脂添加量對脂質體包封率的影響：固定α-淀粉抑制酶的添加量為2.0 mg/mL、膽固醇添加量為8.0 mg/mL、攪拌溫度為50℃時，考察卵磷脂添加量為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg/mL時，納米脂質體的包封率。

攪拌溫度對脂質體包封率的影響：固定α-淀粉抑制酶的添加量為2.0 mg/mL、膽固醇添加量為8.0 mg/mL、卵磷脂添加量為0.20 mg/mL時，考察攪拌溫度為20、30、40、50、60、70、80、90 ℃時，納米脂質體的包封率。

1.2.3 正交試驗 基于單因素實驗基礎上，采用L9（34）四因素三水平正交試驗方案設計，優(yōu)化納米脂質體的生產工藝配方，試驗因素與水平見表1。

表1 L9（34）因素與水平Table 1 Factors and levels of L9(34)

1.2.4 包封率的測定 取1 mLα-淀粉抑制酶納米脂質體，加入5.0 mL石油醚充分混勻，4000 r/min條件下離心5 min，收集上清液揮干溶劑，測上清液中α-淀粉抑制酶的質量濃度C（mg/mL），包封率的計算公式如下[19-21]：

式中：M為α-淀粉抑制酶添加量，mg；V為脂質體懸浮液的總體積，mL。

1.2.5α-淀粉抑制酶納米脂質體粒徑測定 將α-淀粉抑制酶納米脂質體用去離子水稀釋至適當倍數(shù)，隨后將稀釋后的樣品裝入聚苯乙烯比色皿中，采用粒徑分析儀進行測定，散射角為90°，記錄α-淀粉抑制酶納米脂質體的粒徑。

1.2.6α-淀粉抑制酶納米脂質體的貯藏穩(wěn)定性 溫度對納米脂質體的貯藏穩(wěn)定性的影響：將α-淀粉抑制酶納米脂質體注滿并密封在棕色瓶中，分別在4、25、37 ℃條件下，避光貯藏40 d，每10 d測定其平均粒徑。

pH對納米脂質體貯藏穩(wěn)定性的影響：將α-淀粉抑制酶納米脂質體注滿并密封在棕色瓶中，分別調節(jié)體系的pH為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5，避光貯藏40 d，每10 d測定其平均粒徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗中所有數(shù)據(jù)均采用Excel2003軟件處理并繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1α-淀粉抑制酶對產品包封率的影響 結果如圖1所示，α-淀粉抑制酶添加量對納米脂質體的包封率影響呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。在α-淀粉抑制酶添加量較低的情況下，由于溶質分子的質量濃度低，增加了脂質體在形成過程中與α-淀粉抑制酶分子的結合難度，從而使得包封率效果較差；在添加量為2.0 mg/mL時，納米脂質體的包封率的最高，此時納米脂質體中的α-淀粉抑制酶含量最高；繼續(xù)增加α-淀粉抑制酶的量，納米脂質體的包封率迅速下降，所以α-淀粉抑制酶的添加量選擇1.5～2.5 mg/mL之間較適宜。

圖1 α-淀粉抑制酶對產品包封率的影響（n=3）Fig.1 Effect of α-amylase inhibitor on encapsulation efficiency of products（n=3）

2.1.2 膽固醇添加量對產品包封率的影響 由圖2結果可知，當膽固醇添加量較低時，納米脂質體的包封率較低，這主要是由于過低的固態(tài)脂在制備過程中不利于形成可以容納更多α-淀粉抑制酶的脂質載體；當膽固醇添加量為8.0 mg/mL時，納米脂質體的包封率最高，此時納米脂質體中的α-淀粉抑制酶含量最高；再增加膽固醇的量，對納米脂質體中的α-淀粉抑制酶含量整體改善不大，甚至下降，所以膽固醇添加量選擇6.0～10.0 mg/mL之間較適宜。

圖2 膽固醇添加量對產品包封率的影響（n=3）Fig.2 Effect of cholesterol content on encapsulation efficiency of products（n=3）

2.1.3 卵磷脂添加量對產品包封率的影響 由圖3結果可知，當卵磷脂添加量較低時，納米脂質體的包封率較低，這主要是由于過低的液態(tài)脂會增大納米脂質載體的平均粒徑，降低體系的穩(wěn)定性，從而使得包封率效果較差；當卵磷脂的添加量為0.20 mg/mL時，納米脂質體的包封率最高，此時納米脂質體中的α-淀粉抑制酶含量最高；再增加卵磷脂的量，納米脂質體的包封率會逐漸下降，所以卵磷脂添加量選擇0.15～0.25 mg/mL之間較適宜。

圖3 卵磷脂添加量對產品包封率的影響（n=3）Fig.3 Effect of lecithin content on encapsulation efficiency of products（n=3）

圖4 攪拌溫度對產品包封率的影響（n=3）Fig.4 Effect of stirring temperature on encapsulation efficiency of products（n=3）

2.1.4 攪拌溫度對產品包封率的影響 由圖4結果可知，發(fā)現(xiàn)反應溫度為60 ℃時，納米脂質體的包封率最高，此時納米脂質體中的α-淀粉抑制酶含量最高；再增加反應溫度，納米脂質體的包封率會快速下降，因為脂質體的制備必須控制溫度高于卵磷脂的相變溫度，這樣才能使卵磷脂溶液中分散均勻，有利于形成結構良好的脂質體，但溫度過高會使卵磷脂發(fā)生部分氧化[22]，從而影響包封率，綜合考慮攪拌溫度選擇50～70 ℃之間較適宜。

2.2 正交優(yōu)化實驗

從表2可以看出，各因素影響力的主次順序為α-淀粉抑制酶添加量＞攪拌溫度＞膽固醇添加量＞卵磷脂添加量，最優(yōu)組合為A2B2C3D3，即最佳釀造條件為α-淀粉抑制酶添加量為2.0 mg/mL，膽固醇添加量為8.0 mg/mL，卵磷脂添加量為0.25 mg/mL，攪拌溫度為70 ℃。通過進一步的驗證試驗，在最佳條件下生產出來的產品包封率達到91.6%，比正交試驗表中所有實驗組別的產品包封率都高，故可確定其最佳工藝條件為A2B2C3D3。

表2 L9（34）正交試驗方案及結果分析Table 2 Test scheme and result analysis of L9(34) orthogonal

2.3 α-淀粉抑制酶納米脂質體粒徑分析

采用Nano-Zs90粒徑分析儀測得α-淀粉抑制酶納米脂質體的粒徑分布圖如圖5所示。

圖5 α-淀粉抑制酶納米脂質體的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of α-amylase inhibitor nanoscale carrier

結果如圖5所示，α-淀粉抑制酶納米脂質體粒徑的平均粒徑為70.2 nm，粒徑分布范圍較窄、分布區(qū)域比較均勻，表明所制備的α-淀粉抑制酶納米脂質體粒徑分布在納米級范圍。

2.4 貯藏穩(wěn)定性試驗

2.4.1 溫度對α-淀粉抑制酶納米脂質體貯藏穩(wěn)定性的影響 由圖6可知，α-淀粉抑制酶納米脂質體在37℃的條件下貯藏40 d后，載體體系的平均粒徑從70.2 nm增加至568.3 nm，體系的穩(wěn)定性能下降，這可能是由于溫度高，載體體系的運動能量較高，加速納米脂質體之間的碰撞，從而導致納米脂質體之間團聚的幾率增加，使得其粒徑增大。α-淀粉抑制酶納米脂質體在4℃的條件下貯藏40 d后，載體體系的平均粒徑也增大了860%，粒度分布范圍變寬，可能是由于溫度過低，使得α-淀粉抑制酶納米脂質體的沉淀結晶加劇，體系穩(wěn)定性被破壞，導致納米脂質體絮凝[23-24]。在貯藏期內，25 ℃條件下貯藏的α-淀粉抑制酶納米脂質體的平均粒徑小于其他兩組，載體體系穩(wěn)定性最好，且外觀基本未發(fā)生變化，到第40 d時體系仍澄清透明；但是在4和37 ℃條件下，體系外觀變化明顯，到40 d時體系較貯藏開始時明顯渾濁，因此α-淀粉抑制酶納米脂質體應盡可能室溫條件下貯藏。

圖6 溫度對α-淀粉抑制酶納米脂質體平均粒徑的影響（n=3）Fig.6 Effect of temperature on particle size of α-amylase inhibitor nanoscale carrier（n=3）

圖7 pH對α-淀粉抑制酶納米脂質體平均粒徑的影響（n=3）Fig.7 Effect of pH on particle size of α-amylase inhibitor nanoscale carrier（n=3）

2.4.2 pH對α-淀粉抑制酶納米脂質體貯藏穩(wěn)定性的影響 由圖7可知，貯藏實驗開始時，α-淀粉抑制酶納米脂質體在不同pH條件下，載體體系的粒徑差別不大，分布比較均一，載體體系穩(wěn)定。當α-淀粉抑制酶納米脂質體貯藏40 d后，不同pH貯藏條件下載體體系粒徑呈現(xiàn)上升的趨勢，且不同pH之間的平均粒徑差異也顯著（P＜0.05），特別是pH為5.5時，粒徑顯著高于其他組，可能是由于在這一條件下，載體體系正電荷的作用使粒子帶電量到達等電點附近，因納米脂質體間的斥力減小而發(fā)生了聚集[25]。α-淀粉抑制酶納米脂質體在貯藏40 d后，載體體系的平均粒徑都在200 nm以下，體系外觀良好，故α-淀粉抑制酶納米脂質體可以應用于pH為3.5～7.5的體系當中。

3 結論

本試驗研究了生產α-淀粉抑制酶納米脂質體的工藝條件，優(yōu)化工藝后生產出的納米脂質體的包封率能達到91.6%。采用粒徑分析儀測得α-淀粉抑制酶納米脂質體的平均粒徑為70.2 nm，粒徑分布范圍較窄、分布區(qū)域比較均勻。在貯藏穩(wěn)定性試驗中發(fā)現(xiàn)，α-淀粉抑制酶納米脂質體在25℃室溫條件下以及pH為3.50～7.50的體系中較穩(wěn)定，有效解決了α-淀粉抑制酶的穩(wěn)定性差和利用率低的問題，為進一步的商業(yè)開發(fā)提供可能。