微波輔助提取巴旦木蛋白工藝優化及其功能性質研究

楊文敏，楊 冬，任昊天

（黑龍江省綠色食品科學研究院，黑龍江哈爾濱 150028）

巴旦木（Amygdalus communisL.）又名巴旦杏，是薔薇科李亞科桃屬喬木，因其外形扁如桃，又名扁桃，為世界上著名的木本油料和干果樹種[1]。巴旦木作為堅果，不但具有很好的口感，其營養價值也極高，巴旦木含有豐富的蛋白質、脂肪、膳食纖維等，是諸多營養物質的良好資源，如單不飽和脂肪酸、α-生育酚、多種維生素、無機鹽、精氨酸、植物甾醇和多酚類物質等[2-4]。但目前國內外針對于巴旦木蛋白的提取和應用報道較少，孫月娥等[2]采用堿提酸沉法和超聲輔助堿法提取巴旦木蛋白工藝的研究，陶永霞等[5]采用酶法制備巴旦木蛋白，但還未見采用微波輔助堿法提取巴旦木蛋白的相關報道。

本研究通過單因素實驗和正交試驗對微波輔助堿法提取巴旦木蛋白的工藝條件進行研究，并進一步對微波輔助減法提取的巴旦木蛋白與未經微波輔助提取的巴旦木蛋白的功能性質進行對比評價，旨在為提取、開發利用巴旦木蛋白和工業化生產巴旦木蛋白提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴旦木 哈爾濱南極百貨批發市場新疆產薄殼類品種；石油醚、考馬斯亮藍G-250、氫氧化鈉、鹽酸、苯酚、濃硫酸、十二烷基磺酸鈉等試劑 分析純，國藥集團。

Buchi凱式定氮儀 瑞士Buchi實驗室設備有限公司；722型紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表廠；JB-2型恒溫磁力攪拌器 上海新涇儀器有限公司；TDL-4離心機 安亭科學儀器廠；PHS-25系列酸度計、AUY120分析天平 上海精密科學儀器有限公司；HH-4數顯恒水浴鍋 索式抽提器 南京晚晴化玻儀器有限公司；數顯鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；微波儀 上海新儀微波化學科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巴旦木基本成分含量的測定 水分：按照GB 5009.3-2016中直接干燥法進行測定；粗蛋白：按照GB 5009.5-2016中凱氏定氮法進行測定；粗脂肪：按照GB 5009.6-2016中索氏抽提法進行測定；總糖：苯酚-硫酸法[6]，標曲方程為y=11.012x+0.0132，R2=0.9989；灰分：按照GB 5009.3-2016進行測定。

1.2.2 巴旦木的脫脂 對巴旦木的脫脂操作參考孫月娥等[2]的方法進行。將巴旦木手工去殼后于40 ℃烘箱干燥，粉碎過40目篩，室溫下用石油醚（30～60 ℃）脫脂3 h，置通風櫥中12 h以揮發溶劑，得脫脂巴旦木粕，于4 ℃保存備用。

1.2.3 微波輔助提取巴旦木蛋白的工藝流程 將脫脂巴旦木粕以一定料液比制成溶液，并用0.5 mol/L NaOH溶液調節pH至9.5，然后將溶液置于微波儀中進行微波處理，之后在4500 r/min下離心20 min并收集上清液，并用1 mol/L的鹽酸調節上清液pH至4.5，此后對上清液再次進行離心處理收集沉淀并水洗，重復該操作數次直至水洗為中性，最后將沉淀物凍干，即得到巴旦木蛋白。

1.2.4 單因素實驗設計 以巴旦木蛋白提取率為指標，選取微波功率、微波時間、提取液pH、提取溫度和料液比5個因素進行單因素實驗，考察各因素對巴旦木蛋白提取率的影響。

1.2.4.1 微波功率對巴旦木蛋白提取率的影響 固定微波時間為180 s，提取液pH為9.5，提取溫度為45 ℃，料液比為1:25 g/mL，研究微波功率（100、200、300、400、500、600、700 W）對巴旦木蛋白提取率的影響；

1.2.4.2 微波時間對巴旦木蛋白提取率的影響 固定微波功率400W，提取液pH為9.5，提取溫度為45℃，料液比為1:25 g/mL，研究微波時間（90、120、150、180、210、240、270 s）對巴旦木蛋白提取率的影響；

1.2.4.3 提取液pH對巴旦木蛋白提取率的影響 固定微波功率400 W，微波時間180 s，提取溫度45 ℃，料液比為1:25 g/mL，研究提取液pH（8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11.0）對巴旦木蛋白提取率的影響；

1.2.4.4 提取溫度對巴旦木蛋白提取率的影響 固定微波功率400 W，微波時間180 s，提取液pH為9.5，料液比為1:25 g/mL，研究提取溫度（30、35、40、45、50、55、60 ℃）對巴旦木蛋白提取率的影響；

1.2.4.5 料液比對巴旦木蛋白提取率的影響 固定微波功率400 W，微波時間180 s，提取液pH為9.5，提取溫度為45 ℃，研究料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40 g/mL）對巴旦木蛋白提取率的影響。

1.2.5 正交試驗設計 在單因素實驗設計基礎上，對影響巴旦木蛋白提取率的主要因素微波功率、微波時間、提取液pH、提取溫度和料液比進行L16（45）正交試驗，因素水平見表1。

表1 L16（45）試驗設計的因素水平設計Table 1 Levels and factors of L16 (45) orthogonal experiment

1.2.6 巴旦木蛋白的提取率計算 采用考馬斯亮藍法測定提取液中的蛋白質含量，按照下式計算蛋白提取率：

1.2.7 巴旦木蛋白功能性的測定 采用正交試驗優化的最佳條件提取巴旦木蛋白，然后冷凍干燥并于-4℃條件下冷藏備用，進一步分別測定巴旦木蛋白的溶解性、持水性和持油性、乳化性和乳化穩定性、起泡性和起泡穩定性等功能性質，以未經微波處理且相同其他條件下提取的巴旦木蛋白作為對照。

1.2.7.1 溶解性的測定 蛋白質溶解性的測定參考李永恒等[7]的方法進行。配制1 g/100 mL的蛋白溶液，調節蛋白溶液pH至7.0，混勻后在室溫下震蕩30 min，取出10 mL在4000 r/min下離心20 min，倒出上清液并定容至25 mL，再取出10 mL上清液測定其中蛋白質含量，上清液中的蛋白質含量和樣品中的總蛋白質含量均采用采用考馬斯亮藍法進行測定。蛋白質溶解性用溶氮指數（NSI）來表示，測定公式如下：

1.2.7.2 持水性和持油性的測定 蛋白質持水性和持油性測定參考李永恒等[7]方法進行。取1 g蛋白樣品放入離心管中，稱量質量m1，加入10 mL蒸餾水/大豆油，混勻并在室溫下靜置30 min。然后在4000 r/min下離心20 min，棄去上清液。測量離心管和沉淀的總質量m2。持水性和持油性的計算公式如下：

式中，m0為蛋白樣品的質量，g；m1為蛋白與離心管的質量，g；m2為離心后沉淀物與離心管的質量，g。

1.2.7.3 乳化性和乳化穩定性的測定 蛋白質乳化性和乳化穩定性的測定參考李永恒等[7]方法進行。用蒸餾水配制濃度為0.1 g/100 mL的蛋白溶液。用1 mol/L的氫氧化鈉溶液和1 mol/L的鹽酸溶液調節蛋白溶液pH至7.0。分別取30 mL溶液于燒杯中，加入10 mL的大豆油，在10000 r/min下均質1 min。然后立即從燒杯底部取200 μL溶液加到0.1%的SDS溶液中，以0.1%的SDS溶液作為空白對照，于500 nm波長下測定吸光值A0。室溫下靜置10 min后再次取樣，測定吸光值A1。乳化性（EAI）和乳化穩定性（ESI）的計算公式如下：

式中：A0為0時刻的樣品吸光值；A1為10 min時的樣品吸光值；N為稀釋倍數；φ為油相所占的體積分數；L為比色皿的光路長度，1 cm；c為蛋白的質量濃度，g/mL；T0為放置時間為0min；T為放置時間10 min。

1.2.7.4 起泡性和氣泡穩定性的測定 起泡性和氣泡穩定性的測定參考李永恒等[7]方法進行。用蒸餾水配制1 g/100 mL的蛋白溶液。用1 mol/L的氫氧化鈉溶液和1 mol/L的鹽酸溶液調節蛋白溶液pH至7.0。分別取50 mL溶液于燒杯中，用高速均質機在10000 r/min條件下均質2 min。均質后立即轉移至量筒中并測定體積V1，30 min后再次測定體積V2。起泡性（FC）和泡沫穩定性（FS）的計算公式如下：

式中：V0為均質前溶液體積，mL；V1為均質2 min后的溶液體積，mL；V2為均質后靜置30 min后的溶液體積，mL。

1.3 數據處理

所有單因素及正交試驗分別進行3次平行試驗，結果以x±s表示，并采用Origin 9.2進行圖表繪制，SPSS 23.0分析軟件對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 巴旦木基本成分

從表2中可以看出，巴旦木中含有較多的蛋白質和脂肪，可以進一步用于提取蛋白質和脂肪，因此，具有很好的開發和利用價值以提高該特產資源的附加值。

表2 巴旦木基本成分Table 2 Basic chemical of composition of almond seed kernel

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 微波功率對蛋白質提取率的影響 由圖1可見，隨著微波功率的不斷提高，巴旦木蛋白的提取率也隨之增加，當功率達到400 W時，蛋白提取率達到最大值，這是由于在微波功率較低時，巴旦木蛋白有效成分還未完全釋放，隨著微波功率的升高，有效成分的釋放程度也隨之增加[8]，因此，巴旦木蛋白的提取率呈上升趨勢。此后，隨著微波功率繼續增大至700 W時，巴旦木蛋白的提取率反而出現明顯的下降，這可能是當微波功率進一步增加時會導致溫度升高，微波的強熱效應會引起蛋白質發生熱變性[9]，并且還會造成雜質成分被釋放出來[8]，從而降低了巴旦木蛋白的提取率，因此綜合考慮，選取微波功率為300～600 W范圍用于進一步的正交優化試驗。

圖1 微波功率對巴旦木蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power on almond seed kernel protein extraction yield

2.2.2 微波時間對蛋白質提取率的影響 由圖2可見，當微波時間小于180 s時，隨著微波時間的增加巴旦木蛋白提取率不斷增大，當達到180 s時，蛋白提取率達到最大值，此后，隨著微波時間進一步延長，蛋白提取率反而逐漸下降。巴旦木蛋白中的肽鍵和部分氨基酸側鏈等極性基團在微波的作用下會產生振動而促進蛋白質分子結構逐漸松散，從而有利于可溶性蛋白的溶出，表現為較高的蛋白提取率[7,10]；然而，微波時間較短時卻不足以促進巴旦木中的可溶性蛋白得到充分釋放；相反，微波時間過長則會引起物料溫度升高而導致蛋白被破壞，并造成蛋白變性程度加深，引起水溶性氮含量的下降[11-12]，從而影響了對蛋白質的提取效果。綜合考慮，選取微波時間150～240 s進行進一步的正交優化試驗。

圖2 微波時間對巴旦木蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of microwave time on almond seed kernel protein extraction yield

2.2.3 提取液pH對巴旦木蛋白提取率的影響 從圖3中可以看出，當提取液pH小于10.0時，巴旦木蛋白的提取率隨著pH的升高而逐漸增加，當pH達到10.0時，蛋白提取率達到最大值，由于巴旦木蛋白中清蛋白含量最為豐富[13]，而清蛋白易溶于稀堿溶液，所以巴旦木蛋白的提取率會隨著pH的升高而不斷增加。此后，隨著pH的繼續增加，蛋白提取率呈現下降趨勢，這可能是由于提取液堿性增強，會部分改變蛋白質分子表面的電荷數量及分布，增加了蛋白質的水溶解性，在酸沉淀過程中造成了部分蛋白質的損失[14-15]；而當堿性過強時，容易出現蛋白質脫氨、脫羧、肽鍵斷裂等現象，這會引起胱賴反應而產生有毒物質[2]，并會產生不良異味，造成蛋白質的損失，從而導致蛋白質的提取率降低。綜合考慮，選取提取液pH9.0～10.5進行進一步的正交優化試驗。

圖3 提取液pH對巴旦木蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction pH on almond seed kernel protein extraction yield

2.2.4 提取溫度對蛋白提取率的影響 由圖4可知，巴旦木蛋白的提取率隨著提取率溫度的升高表現出先升高后降低的趨勢，并且在提取溫度為50 ℃時蛋白的提取率最高。在蛋白提取的過程中，蛋白質分子結構的構象會隨著提取溫度的升高發生一定變化，主要表現為升溫能夠促使蛋白質分子的立體結構逐漸疏松，這有利于蛋白質分子和水分子之間的相互作用，促進了蛋白質的溶解，從而起到了對蛋白質的增溶效果[7,16]；然而，當提取溫度超過50 ℃以后，隨著提取溫度的繼續升高，會造成維系蛋白質空間構象的較弱作用力和次級鍵減弱或斷裂，導致更多的非極性基團暴露在蛋白分子表面，這會降低蛋白質分子和水分子之間的相互作用而促進了蛋白質分子之間的結合并形成沉淀[5]，從而影響了巴旦木蛋白的提取率。綜合考慮，選取提取溫度40～55 ℃進行進一步的正交優化試驗。

圖4 提取溫度對巴旦木蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on almond seed kernel protein extraction yield

2.2.5 料液比對蛋白質提取率的影響 由圖5可知，料液比在1:10～1:25 g/mL范圍時，隨著提取溶劑比例的增加，巴旦木蛋白的提取率也隨之升高，這可能是因為適當提高提取溶劑加入的比例能夠增強溶質的分散程度，促進了溶質與溶劑之間的接觸，這有利于蛋白質的充分溶出，從而提高了蛋白質的提取率[16-17]；此后隨著提取溶劑加入比例繼續增加時，蛋白質的提取率出現了略微下降的趨勢，這是由于提取溶劑加入過多，會導致蛋白質分子與水分子間的相互作用增加，反而會導致的蛋白質分子不易于沉淀，在酸沉淀過程會有一部分蛋白質流失到上清液中，從而造成了蛋白質的損失[18]。此外，料液比過低時，會導致提取溶劑的浪費，并會增加后處理的負擔，使產品成本增加，綜合考慮實際生產及經濟因素，確定選取料液比1:20～1:35 g/mL進行進一步的正交優化試驗。

圖5 料液比對巴旦木蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of material/liquid ratio on almond seed kernel protein extraction yield

2.3 正交試驗結果

在單因素實驗基礎上，以微波功率、微波時間、提取液pH、提取溫度和料液比為因素，以蛋白提取率為指標設計L16（45）正交試驗優化微波輔助提取巴旦木蛋白的最佳工藝參數，正交試驗結果見表3。

由表3的極差分析可知，影響微波輔助提取巴旦木蛋白的因素順序依次為：微波功率＞提取溫度＞料液比＞提取液pH＞微波時間。以蛋白提取率為指標優化的理論最佳提取工藝因素水平組合為A2B2C2D3E2，即微波溫度400 W、微波時間180 s、提取液pH9.5、提取溫度50 ℃和料液比1:25 g/mL時，巴旦木蛋白的提取率達到最高。參照此最佳組合條件實施平行試驗，測出巴旦木蛋白提取率為46.69%。相較于未經微波處理而相同其他條件下測定得到的巴旦木蛋白提取率31.28%可以看出，采用微波輔助堿提法能夠顯著提高巴旦木蛋白的提取率。

2.4 巴旦木蛋白質功能性質的評價

蛋白質的功能性質包括溶解性、持水性、持油性、起泡性和氣泡穩定性、乳化性和乳化穩定性等。蛋白質的這些功能性質對食品的可加工性能以及產品的口感、質地等食用品質等具有重要的影響。因此，通過測定巴旦木蛋白這5個性質指標，對比分析微波處理對提取的巴旦木蛋白功能性質的影響，結果如表4所示。

從表4中可以看出，微波輔助提取的巴旦木蛋白的溶解性、持水性、持油性、乳化性和起泡性分別為55.24%、4.11 g/g、6.21 g/g、25.94 m2/g和74.86%，相較于未經微波處理的巴旦木蛋白，其溶解性、持水性、持油性、乳化性和起泡性分別提升了15.35%、26.07%、26.22%、30.61%和20.53%，然而，微波輔助提取的巴旦木蛋白的乳化穩定性和泡沫穩定性略有降低，降低幅度分別為1.05%和13.29%。巴旦木蛋白在微波的作用下，其蛋白質分子內部的二硫鍵斷裂并形成巰基，這阻礙了蛋白質之間的聚集，同時，蛋白分子結構的伸展有利于水分向其內部的進入，這促進了親水基團與水分子的充分結合，因此，微波處理后蛋白的溶解性和持水性均得到提高[7,19]。蛋白質的起泡性、乳化性等功能性質與其溶解性大小密切相關，隨著蛋白質溶解性的增大，蛋白更易于向氣-水或油-水界面擴散并降低表面張力，從而提高了蛋白質的起泡性和乳化性等功能性質[20]。

表3 正交試驗結果Table 3 Orthogonal experiment results

3 結論

在微波輔助提取巴旦木蛋白的實驗中，影響巴旦木蛋白提取率的因素順序依次為：微波功率＞提取溫度＞料液比＞提取液pH＞微波時間。通過正交優化試驗得到微波輔助提取巴旦木蛋白的最佳工藝條件為：微波溫度400 W、微波時間180 s、提取液pH 9.5、提取溫度50 ℃和料液比1:25 g/mL，在此條件下測出巴旦木蛋白提取率可達到46.69%。相較于未經微波處理而相同其他條件下提取的巴旦木蛋白來說，微波處理顯著提高了巴旦木蛋白的功能性質，如溶解性、持水性、持油性、乳化性和起泡性分別提升了15.35%、26.07%、26.22%、30.61%和20.53%，但乳化穩定性和泡沫穩定性略有降低，降低幅度分別為1.05%和13.29%。研究結果表明對巴旦木進行合理的微波處理，有助于提高巴旦木蛋白的提取率并改善功能性質。

表4 微波預處理與未經微波預處理的巴旦木蛋白功能性質比較Table 4 Comparison of functional properties of microwave-assisted extracted and commonly extracted almond seed kernel proteins