龍牙楤木中酚類物質提取方法的比較

朱定波，徐 衛

（重慶市第九人民醫院藥劑科，重慶 400700）

龍牙楤木（Aralia elata（Miq.） Seem.），別稱刺老芽，刺龍芽，是五加科（Araliaceae）楤木屬（Aralia）植物，廣泛分布于亞洲地區，在我國東北三省儲量極為豐富[1]。龍牙楤木是藥，食兼用植物，其根，樹皮，葉具有補氣安神，活血通絡，除濕止痛等功效[2]。常用于滋補，治療關節炎、神經衰弱、糖尿病、肝炎、心肌缺血等癥[3]。其嫩芽中含有人體必需的多種氨基酸和微量元素[4-5]。近年來，關于龍牙楤木的研究，主要集中在對其皂苷類化合物的分離、鑒定及藥理活性等相關研究[6-10]，以及具有抗輻射損傷、抗腫瘤及抗氧化等作用的多糖[11-12]，而對其酚類物質研究較少[13-14]。

多酚是一類廣泛存在于植物體內的復雜酚類次生代謝產物，具有獨特化學結構，在抗氧化、抑菌、延緩衰老、抑制心血管疾病及抗癌等方面表現出顯著功效[15-16]。因多酚在自然界分布的廣泛、儲量的豐富、生理功能的多樣，農業、林業、食品、醫藥等領域的眾多學者對多酚進行了基礎和應用研究[17]，其在醫藥、食品、保健品及日用化學品等方面得到了廣泛應用。

本文采用溶劑浸提法、溶劑回流法、超聲輔助法、微波輔助法及復合酶法，提取龍牙楤木中酚類物質，分析不同提取方法對龍牙楤木中酚類物質得率的影響，并利用正交試驗優化提取工藝，確定最佳提取工藝參數，為開發利用龍牙楤木中酚類物質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍牙楤木嫩葉 于2019年5月中旬采自吉林白山長白朝鮮族自治縣，由西北農林科技大學生物學博士后徐洪宇鑒定為五加科植物龍牙楤木（Aralia elata(Miq.) Seem.）的葉片，45 ℃干燥、粉碎，過80目篩備用；復合植物水解酶ViscozymeL（非淀粉復合糖酶，含果膠酶和各種碳水化合物酶，包括阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶和木聚糖酶等）諾維信中國生物技術有限公司；福林酚 天津市大茂化學試劑廠；沒食子酸、蘆丁 國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸鈉、無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉等

均為分析純。

FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ3200DE型數控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；722s可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；FA1004A型分析天平 上海精天電子儀器；RE-52AA型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；DK-98-ⅡA型恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同提取方法對龍牙楤木中酚類物質含量的影響

1.2.1.1 溶劑浸提法提取 參考Paz等[18]方法略作修改。稱取龍牙楤木粉末0.500 g于錐形瓶中，加10 mL體積分數為70%的乙醇溶液（料液比1:20 g/mL），在室溫條件下浸提12 h，抽濾，收集提取液。重復上述提取3次，合并提取液，定容至50 mL，備用，測其總酚、總黃酮得率。

1.2.1.2 溶劑回流法提取 參考Paz等[18]方法，略作修改。稱取龍牙楤木粉末0.500 g于250 mL圓底燒瓶中，加100 mL體積分數為70%的乙醇溶液（料液比為1:200 g/mL），加沸石，在80 ℃恒溫水浴鍋中回流1 h，抽濾，收集提取液。重復上述提取3次，合并提取液，濃縮，定容至50 mL，備用，測其總酚、總黃酮得率。

1.2.1.3 超聲輔助法提取 參考Persic等[19]方法，略作修改。稱取龍牙楤木粉末0.500 g于錐形瓶中，加10 mL體積分數70%乙醇溶液（料液比1:20 g/mL），超聲（150 W）提取30 min，超聲溫度50 ℃，抽濾，收集提取液。重復上述提取3次，合并提取液，定容至50 mL，備用，測其總酚、總黃酮得率。

1.2.1.4 微波輔助法提取 參考Alonso-Castro等[20]加10 mL體積分數為70%的乙醇溶液（料液比為1:20 g/mL），將錐形瓶置于微波爐中，在微波功率480 W，微波時間40 s，待樣品溶液冷卻至室溫，抽濾，收集提取液。重復上述提取3次，合并提取液，定容至50 mL，備用，測其總酚、總黃酮得率。

1.2.1.5 復合酶法提取 參考朱建星等[21]方法，略作修改。稱取龍牙楤木粉末0.500 g于錐形瓶中，加10 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（料液比1:20 g/mL），pH為4.0，加入復合植物水解酶120 μL/g（酶量/樣品量），50 ℃條件下酶解2 h，90 ℃水浴滅酶10 min，抽濾，收集提取液，濾渣中加入10 mL體積分數為70%的乙醇溶液，室溫浸提1 h，抽濾，收集提取液。重復上述提取3次，合并提取液，濃縮，定容至50 mL，備用，測其總酚、總黃酮得率。

1.2.2 復合酶法提取單因素實驗 在酶解pH為4.0，分別加入80、100、120、140、160 μL/g復合植物水解酶，50 ℃條件下酶解1 h，70%乙醇溶液浸提濾渣，考察酶用量對酚類物質得率的影響。

在酶解pH為4.0，酶用量120 μL/g，分別在20、30、40、50、60 ℃條件下酶解1 h，70%乙醇溶液浸提濾渣，考查酶解溫度對酚類物質得率的影響。

在酶解pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，酶用量120 μL/g，50 ℃條件下酶解1 h，70%乙醇溶液浸提濾渣，考查pH對酚類物質得率的影響。

在酶解pH為5.0，酶用量120 μL/g，50 ℃條件下酶解0.5、1、1.5、2、2.5 h，70%乙醇溶液浸提濾渣，考查酶解時間對酚類物質得率的影響。

在酶解pH為5.0，酶用量120 μL/g，50 ℃條件下酶解1.5 h，體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液浸提濾渣，考查乙醇體積分數對酚類物質得率的影響。

1.2.3 復合酶法提取正交試驗 根據單因素實驗結果，以總酚、總黃酮得率為考察指標，設計L16（35）正交試驗，確定最優酶解提取工藝。因素水平見表1。

1.2.4 酚類物質含量測定

1.2.4.1 總酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu測定法[22]：分別取0.2 mL樣品或不同濃度的沒食子酸標準溶液于試管中（空白組用70%乙醇代替），加入0.1 mol/L的福林酚2.5 mL，5 min后加入7.5% Na2CO3溶液2.5 mL，在室溫避光下反應2 h，于725 nm波長下測定其吸光度，繪制不同濃度的沒食子酸標準溶液（x）與對應吸光度（y）之間的標準曲線y=2.105x+0.1538（R2=0.9992）。根據標準曲線，按公式（1）計算總酚得率（%）。

表1 正交試驗因素及水平設計Table 1 Factors and levels of extraction experiment

式中：C為沒食子酸質量濃度，mg/mL；n為提取液稀釋倍數；V為提取液的總體積，mL；m為龍牙楤木樣品質量，g。

1.2.4.2 總黃酮含量的測定 參照文獻[23]，吸取1 mL樣品或不同濃度的蘆丁標準溶液于試管中（空白組用70%乙醇代替），加入4 mL 70%的乙醇溶液，0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液；6 min后加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液；6 min后再加4 mL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液，0.4 mL水，放置15 min，于510 nm波長下測定其吸光度，繪制不同濃度的蘆丁標準溶液（a）與對應吸光度（b）之間的標準曲線y=0.6446x+0.1726（R2=0.9991）。根據標準曲線，按公式（2）計算總黃酮得率（%）。

式中：C為蘆丁質量濃度，mg/mL；n為提取液稀釋倍數；V為提取液的總體積，mL；m為龍牙楤木樣品質量，g。

1.3 數據處理

試驗數據使用SPSS 22軟件進行統計分析，采用SNK法進行顯著性檢驗（P＜0.05），每個樣品重復3次試驗，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法比較

采用溶劑浸提法、溶劑回流法、超聲輔助法、微波輔助法及復合酶法，共5種方法提取龍牙楤木中酚類物質，以總酚和總黃酮得率作為考察指標，實驗結果見表2。

不同提取方法提取酚類物質的原理不同，溶劑浸提和溶劑回流法提取均是利用相似相溶原理對目標成分進行提取的方法。溶劑回流法相較于溶劑浸提法增加了提取溫度，有利于酚類物質的溶出，表2中，溶劑回流法得到的總酚、總黃酮得率（2.38%，1.05%）高于溶劑浸提法（1.95%，0.96%）；超聲輔助法提取是利用超聲波形成的空化效應，使植物組織細胞產生破裂，釋放內容物，加速提取過程，提高提取效率，本實驗中總酚得率為4.32%，總黃酮得率為1.52%；微波輔助法是利用微波在傳遞過程中穿透植物體，植物體吸收微波產生熱能，使細胞內部水分氣化，產生的壓力使細胞膜破裂，內容物溶出，此方法得到的總酚得率為5.93%、總黃酮得率為2.25%；而復合酶法提取是利用植物復合酶（由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等組成的混合酶系），使細胞壁在酶的作用下軟化、膨脹和崩潰等，進而改變細胞壁的通透性，從而提高目標物質的提取效率，通過復合酶法得到的總酚得率為7.09%、總黃酮得率為2.96%。

表2 不同提取方法中龍牙楤木的總酚、總黃酮得率Table 2 Extraction rate of total phenol and flavonoids from Aralia elata by different extraction methods

由表2中可知，不同提取方法得到的總酚、總黃酮得率差異顯著（P＜0.05），其得率大小為：復合酶法＞微波輔助法＞超聲輔助法＞溶劑回流法＞溶劑浸提法。本實驗中復合酶法提取效果強于其他4種方法，此結果與王超等[24]比較了纖維素酶法和超聲波法提取雀兒舌頭中多酚，得出酶法較超聲波法多酚得率提高，以及付曉燕等[25]也證明了酶輔助提取燕麥中酚類物質較溶劑法提取總酚含量更高，結果一致。

本實驗通過5種提取方法的比較，得出復合酶法提取的酚類物質得率高，故選用復合酶法為最佳的提取龍牙楤木中酚類物質的方法，采用正交試驗進一步對復合酶法提取的工藝進行優化。

2.2 復合酶法提取單因素實驗結果

2.2.1 酶用量對酚類物質得率的影響 酶用量對龍牙楤木中酚類物質得率的影響，如圖1所示，隨著酶用量的增加，植物細胞壁破裂更徹底，酚類物質向溶劑中的擴散作用增強，總酚、總黃酮得率增大；當酶加入量增加到一定量后，其總酚、總黃酮得率達到最大，繼續增加酶用量后，酶吸附在物料表面，影響酚類物質的擴散，總酚、總黃酮得率下降。因此，酶用量為120 μL/g時，酚類物質提取效果最佳。

2.2.2 酶解溫度對酚類物質得率的影響 酶解溫度對龍牙楤木中酚類物質得率的影響，由圖2可知，隨酶解溫度升高，龍牙楤木中總酚、總黃酮得率增大，且在50 ℃時得率最高。這是由于復合酶酶解活力在一定溫度范圍內隨溫度升高而增強，酶反應速率加快；當溫度繼續升高時，酶活性降低，酚類物質得率下降[26]。故選取50 ℃為最佳酶解溫度。

圖1 酶用量對酚類物質得率的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on extraction rate of phenolic compounds

圖2 酶解溫度對酚類物質得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of phenolic compounds

2.2.3 pH對酚類物質得率的影響 pH過低或者過高都會影響酶的活力，從而影響酶對植物細胞壁的降解作用，最終影響酚類物質的提取。pH對龍牙楤木中酚類物質得率的影響，由圖3可知，當酶解pH小于5時，隨pH增大龍牙楤木中總酚、總黃酮得率增大，當pH繼續增大后，可能影響酶結構和底物的解離，影響總酚、總黃酮的得率。故本實驗最佳酶解pH為5。

圖3 pH對酚類物質得率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction rate of phenolic compounds

2.2.4 酶解時間對酚類物質得率的影響 酶解時間對龍牙楤木中酚類物質得率的影響，由圖4可知，隨酶解時間的增加，酚類物質得率呈先增加后降低，達到1.5 h時，酚類物質得率達到最大值；當繼續延長酶解時間，總酚、總黃酮得率變化較小，這是因為復合酶在作用一定時間后，細胞內外的酚類物質濃度達到動態平衡，綜合考慮，選擇最佳酶解時間1.5 h。

圖4 酶解時間對酚類物質得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction rate of phenolic compounds

2.2.5 乙醇體積分數對酚類物質得率的影響 乙醇體積分數對酚類物質得率的影響，由圖5可知，乙醇體積分數為40%～80%范圍內，總酚、總黃酮得率呈先增加后減小的趨勢，主要是因為當乙醇體積分數達到50%后，一些醇溶性雜質溶出增加，色素等親脂性強的成分，影響了酚類物質的浸出，致使總酚、總黃酮得率下降，故選用體積分數50%的乙醇為最佳。

圖5 乙醇體積分數對酚類物質得率的影響Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of phenolic compounds

2.3 復合酶法提取正交試驗結果

以總酚得率為指標，得到正交試驗結果（表3，表4），由表3中極差分析可知，各因素對復合酶法提取龍牙楤木中總酚，其影響得率的大小次序為：A＞B＞E＞D＞C，即加酶量＞酶解溫度＞乙醇體積分數＞酶解時間＞酶解pH。通過K值大小得到，最佳工藝組合為A2B2C3D2E2，即酶用量120 μL/g，酶解溫度50 ℃，酶解pH 6，酶解時間為1.5 h，乙醇濃度為50%；方差分析結果如表4所示，因素A加酶量、因素B酶解溫度對總酚得率有極顯著的影響（P＜0.01），因素D酶解時間、因素E乙醇體積分數對總酚得率有顯著影響（0.01≤P＜0.05），因素C酶解pH對總酚得率無顯著影響。因此，采用復合酶法提取龍牙楤木中總酚時，為達到最佳提取效果，需要重點控制加酶量和酶解溫度，其次酶解時間以及乙醇體積分數。

表4 方差分析Table 4 Variance analyses

以總黃酮得率為指標，得到正交試驗結果（表3，表4），由表3中，極差分析可知，各因素對復合酶法提取龍牙楤木中總黃酮，其影響得率的大小次序為：A＞B＞C＞E＞D，即加酶量＞酶解溫度＞酶解pH＞乙醇體積分數＞酶解時間。通過K值大小得到，最佳工藝組合為A2B2C3D2E2，即酶用量120 μL/g，酶解溫度50 ℃，酶解pH6，酶解時間為1.5 h，乙醇濃度為50%；方差分析結果（表4）顯示顯示因素A加酶量對黃酮得率有極顯著的影響（P＜0.01），因素B酶解溫度、因素C酶解pH、因素E乙醇體積分數對總黃酮得率有顯著影響（0.01≤P＜0.05），因素D酶解時間對總黃酮得率無顯著影響。因此，采用復合酶法提取龍牙楤木中總黃酮時，為達到最佳提取效果，需要重點控制加酶量，其次酶解溫度、乙醇體積分數以及酶解pH。

2.4 驗證實驗

按照優化得到的最佳工藝組合A2B2C3D2E2進行重復性試驗3次，總酚、總黃酮的平均得率分別為7.24%、3.17%，RSD值分別為0.73%、0.36%，高于按正交試驗中的最高值7.04%、3.08%，RSD值分別為0.57%、0.32%。

3 結論

采用5種不同的提取方法對龍牙楤木中酚類物質進行提取，以總酚、總黃酮得率為考察指標，得率依次為：復合酶法＞微波輔助法＞超聲輔助法＞溶劑回流法＞溶劑浸提法。利用正交試驗優化復合酶法提取工藝，得到酶用量120 μL/g，酶解溫度50 ℃，酶解pH6，酶解時間1.5 h，乙醇體積分數50%，此工藝條件下，龍牙楤木中總酚得率為7.24%，總黃酮得率為3.17%，提取過程中需要重點控制加酶量和酶解溫度。

本研究利用復合酶法提取龍牙楤木中酚類物質，提取過程溫度低，對酚類物質化學結構影響小，酚類物質得率高，具有一定的實際價值。但本文僅對5中提取方法的單獨提取效果進行了研究，在后續的實驗過程中可以對不同方法進行聯合，例如復合酶法與微波輔助法聯合進行提取，期望進一步提高龍牙楤木中酚類物質的得率。