響應面法優(yōu)化大孔樹脂純化黃芪毛蕊異黃酮工藝

張 沛，吳 楠，宋志軍，邰正福

（1.云南開放大學，云南國防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，云南昆明650500；2.云南經(jīng)濟管理學院醫(yī)學院，云南昆明 650500；3.廣西藥用植物園，廣西南寧 530023；4.四川科倫藥物研究院，四川成都 610000）

黃芪是豆科黃芪屬膜夾黃芪（Astragalus membranceus（Fisch.） Bge.）或蒙古黃芪（Astragalus membranceus（Fisch.） Bge.Var mongholicusBge）的根，因具有補氣固表、利尿脫毒之功效，而常添加在保健食品中[1-2]。

現(xiàn)代分析測試研究表明，黃芪中富含多糖、黃酮、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分，其中毛蕊異黃酮作為黃芪的主要活性成分之一，其含量大小常作為黃芪的品質(zhì)參考，具有抗炎、抗腫瘤、增強機體免疫力等活性[3-4]。趙競業(yè)與Li等曾利用毛蕊異黃酮在兩相溶劑中具有不同的分配系數(shù)的特性，采用高速逆流色譜法對其分離純化，但該方法需配備高速逆流色譜儀，成本較高[5-6]。

由于大孔樹脂吸附分離具有操作簡便、吸附量大、選擇性好、成本低和可反復使用等特點[7-8]，已被廣泛用于多數(shù)天然化合物的分離純化[9-10]，且目前鮮有大孔樹脂純化黃芪毛蕊異黃酮的研究。為此，本研究通過靜態(tài)吸附-洗脫試驗，篩選合適的樹脂型號，并采用單因素與響應面試驗考察不同工藝條件對毛蕊異黃酮的純化效果的影響，從而為該物質(zhì)的后續(xù)深入研究提供理論與實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃芪 云南東駿大藥房經(jīng)廣西藥用植物園，宋志軍老師鑒定為黃芪的干燥根；毛蕊異黃酮對照品上海阿拉丁試劑有限公司；甲醇、甲酸、乙醇、乙酸乙酯 均為色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水 純化水。

FW100型粉碎機 永康市云達機械設(shè)備廠；U3000型高效液相色譜儀 賽默飛-世爾科技公司；ME 104型電子天平 梅特勒-特利多公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；TG18G-II型臺式高速離心機 鹽城凱特實驗儀器有限公司；SHA-C型恒溫振蕩器 國華（常州）儀器制造有限公司；AB-8、H103型大孔樹脂 天津波鴻樹脂科技有限公司；D101、DM130型大孔樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司；DM 301、HPD-600、HPD-400型大孔樹脂 合肥四峰生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物制備 黃芪完全粉碎后過60目篩，稱取一定質(zhì)量粉末，以8倍質(zhì)量的體積分數(shù)為50%的乙醇溶液加熱回流提取3次，合并提取溶劑后減壓回收，所得浸膏溶于50 ℃水，加入乙酸乙酯萃取后，回收溶劑，即得毛蕊異黃酮粗提物[11]。

1.2.2 毛蕊異黃酮含量測定 采用高效液相色譜法測定樣品中毛蕊異黃酮含量[12]。色譜條件：乙腈-水作流動相；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm。準確稱取毛蕊異黃酮對照品10.0 mg置于10 mL容量瓶內(nèi)，加入流動相稀釋至刻度搖勻后，分別準確移取0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL于容量瓶內(nèi)，加入流動相稀釋至刻度，搖勻。隨后，分別以毛蕊異黃酮對照品濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程：y=12769.2x+12.79 （r=0.9992），另將純化后的洗脫液減壓蒸發(fā)，濃縮干燥后稱重，根據(jù)下式計算純化產(chǎn)物的毛蕊異黃酮含量。

1.2.3 靜態(tài)吸附-洗脫性能比較 經(jīng)預處理后的5.0 g七種型號樹脂（H103、D101、AB-8、DM130、HPD-400、DM301、HPD-600）置于錐形瓶內(nèi)，分別加入60 mL 3 mg/mL提取液，于25 ℃振蕩12 h達到吸附平衡后，過濾，測得溶液中毛蕊異黃酮濃度[13]。飽和吸附的樹脂經(jīng)純水清洗后，加入100 mL體積分數(shù)為80%的乙醇溶液，于相同條件振蕩解吸至平衡[14]，照下列公式計算不同類型大孔樹脂的吸附量、吸附率、洗脫率及回收率。

式中：c0為提取液中毛蕊異黃酮濃度，mg/mL；ce為飽和吸附后溶液中毛蕊異黃酮濃度，mg/mL；V0為提取液體積，mL；Vd為洗脫液體積，mL；m為樹脂干重，g；cd為洗脫液中毛蕊異黃酮濃度，mg/mL； τe為飽和吸附量，mg/g；Qe為吸附率，%；Dd為洗脫率，%；R為回收率，%。

1.2.4 吸附等溫曲線 配制體積60 mL濃度分別為0.5、1、2、3、4 mg/mL的提取液，加入裝有5.0 g HPD-400型樹脂的錐形瓶內(nèi)，置于25、30、35 ℃恒溫搖床中，振蕩至飽和吸附后，測得濾液中毛蕊異黃酮的濃度，計算各自飽和吸附量，繪制吸附等溫曲線，同時利用Langmuir、Freundlich模型線性擬合，以描述溶質(zhì)與樹脂的相互作用[15]。

1.2.5 吸附動力學曲線 準確稱取5.0 g大孔樹脂置于錐形瓶內(nèi)，加入60 mL質(zhì)量濃度為3 mg/mL提取液，于25 ℃振蕩吸附，分別于不同吸附時間測定溶液中毛蕊異黃酮濃度，以吸附量為縱坐標，吸附時間為橫坐標，繪制靜態(tài)吸附動力學曲線，采用不同動力學模型闡明HPD-400型樹脂對毛蕊異黃酮的吸附機制[16]。

1.2.6 樹脂吸附條件考察

1.2.6.1 上樣液pH考察 配制五份60 mL、3mg/mL的上樣溶液，分別調(diào)節(jié)溶液pH至3、4、5、6、7，以1 mL/min流速上樣至HPD-400樹脂柱內(nèi)，考察不同上樣液pH對樹脂吸附率影響。

1.2.6.2 泄漏曲線繪制 配制3mg/mL、pH為5的不同體積上樣溶液，分別以1、2、3 mL/min流速上樣至HPD-400樹脂柱內(nèi)，分段收集流出液，檢測毛蕊異黃酮濃度，繪制泄露曲線，當流出液濃度達到上樣液濃度10%時，為樹脂泄漏點；當流出液濃度達到上樣液濃度100%時，為飽和吸附點[17]。

1.2.7 樹脂解吸條件考察

1.2.7.1 洗脫液濃度考察 分別采用體積分數(shù)為55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液作洗脫液，以1 mL/min流速，洗脫飽和吸附后的HPD-400樹脂，分段收集流出液，檢測毛蕊異黃酮濃度，考察不同體積分數(shù)的乙醇溶液對毛蕊異黃酮洗脫率的影響。

1.2.7.2 洗脫曲線繪制 采用體積分數(shù)為80%的乙醇溶液，分別以1、2、3 mL/min流速，洗脫飽和吸附后的HPD-400樹脂，分段收集流出液，檢測毛蕊異黃酮濃度，繪制洗脫曲線。

1.2.8 響應面試驗設(shè)計 在單因素實驗基礎(chǔ)上，固定上樣流速1 mL/min、上樣液體積60 mL、洗脫流速1 mL/min、洗脫液體積140 mL，以上樣濃度（A）、上樣液pH（B）和洗脫液濃度（C）為響應因素，回收率為響應值（Y），設(shè)計三因素三水平響應面試驗，利用Design-Expert軟件的Box-Behnken試驗設(shè)計原理，確定最佳工藝條件，試驗因素水平見表1所示。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，檢驗水準α=0.05，當P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂型號篩選

由于不同型號大孔樹脂的孔徑、比表面積與極性差異較大，因此比較不同類型樹脂對毛蕊異黃酮的吸附與解吸性能，結(jié)果見表2。H103、HPD-400樹脂的靜態(tài)吸附率與洗脫率分別最高，而HPD-400樹脂對樣品中毛蕊異黃酮的回收率最高，推測是因為H103樹脂的比表面積較大，吸附作用較強[18]，而HPD-400樹脂的比表面積適中，且與黃酮化合物具有適當氫鍵作用，因此采用HPD-400大孔樹脂純化黃芪毛蕊異黃酮提取物。

表2 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附性能Table 2 Static adsorption properties of macroporousresin

2.2 樹脂吸附等溫線

圖1為HPD-400樹脂對提取物中毛蕊異黃酮的吸附等溫曲線。在相同吸附溫度下，隨著上樣濃度的逐漸升高，吸附量逐漸增大，但隨著吸附溫度的升高，樹脂吸附量不斷增大，表明該吸附過程為吸熱過程。在25 ℃下，當上樣濃度增大至3 mg/mL時，HPD-400樹脂吸附基本達到飽和，因此確定上樣濃度2、3、4 mg/mL作為響應面因素考察水平。同時為便于實際應用，后續(xù)試驗均選擇在25 ℃下進行。

圖1 不同溫度的吸附等溫曲線Fig.1 Adsorption isotherms at different temperatures

表3為不同溫度下，Langmuir與Freundlich模型對吸附等溫線的擬合參數(shù)，兩種模型擬合方程的相關(guān)系數(shù)均較大（r＞0.97），因此兩種模型均能描述在該濃度范圍內(nèi)的樣品溶液吸附過程，另從Freundlich方程可知，不同溫度的擬合方程中1/n均小于0.5，表明目標化合物較易被吸附于HPD-400大孔樹脂內(nèi)[19]。

2.3 樹脂吸附動力學曲線

圖2為HPD-400樹脂對毛蕊異黃酮的吸附動力學曲線。隨著吸附時間的延長，樹脂對其吸附量逐漸增大，在2 h內(nèi)吸附速率較快，隨后放緩，并于7 h達到平衡。分別采用一級和二級動力學模型擬合上述吸附過程，結(jié)果見表4。采用二級動力學模型擬合方程后，其相關(guān)系數(shù)較大，因此該吸附過程更接近于二級動力學模型特征，吸附過程可能受到外部擴散、邊界層擴散或顆粒內(nèi)擴散控制[20]。

表3 不同溫度的Langmuir與Freundlich模型擬合參數(shù)Table 3 Fitting parameters of Langmuir and Freundlich models at different temperatures

圖2 吸附動力學曲線Fig.2 Curve of adsorption kinetics

表4 吸附動力學模型擬合參數(shù)Table 4 Fitting parameters of adsorption kinetics models

2.4 動態(tài)吸附條件優(yōu)化

2.4.1 上樣液pH對樹脂吸附率的影響 上樣液pH控制提取液中毛蕊異黃酮的離子化程度，進而影響其吸附作用。圖3為不同上樣液pH對樹脂的吸附率影響，隨著上樣液pH的增大，樹脂對目標化合物的吸附率先升高后降低，這歸因于當溶液pH較低時，過量的氫離子與目標化合物競爭吸附樹脂上的活性位點，而溶液pH較高時，毛蕊異黃酮游離出的陰離子減弱與樹脂的氫鍵作用[21]，因此確定上樣液pH 4、5、6作為響應面因素考察水平。

圖3 上樣液pH對吸附率的影響Fig.3 Effect of pH of sample solution on the adsorption rate of HPD-400 resin

2.4.2 泄漏曲線 隨著上樣液體積的增加，樹脂的吸附位點逐漸飽和，吸附能力下降，流出液中目標化合物的濃度逐漸增大，同時上樣流速過快，使得目標化合物與樹脂的接觸時間較短，可能造成樹脂泄漏點的提前，因此考察不同上樣流速的樹脂泄漏曲線，結(jié)果見圖4。當上樣流速分別為1、2、3 mL/min時，樹脂泄漏點對應的上樣體積約為60、40、10 mL，樹脂飽和吸附點則分別約為180、160、140 mL，為了保證上樣液中目標化合物被大孔樹脂盡可能吸附完全，因此確定最佳上樣流速為1 mL/min，上樣液體積為60 mL。

圖4 不同上樣流速的樹脂泄漏曲線Fig.4 Leakage curve in different flow rate of sample solution on HPD-400 resin

2.5 動態(tài)洗脫條件優(yōu)化

2.5.1 洗脫液濃度對解吸率影響 圖5為不同體積分數(shù)的乙醇溶液對目標化合物的洗脫率影響，當乙醇溶液的體積分數(shù)增大至85%后，洗脫率開始緩慢下降，這歸因于毛蕊異黃酮具有糖苷鍵和多酚結(jié)構(gòu)，極性較弱，易被乙醇從吸附樹脂內(nèi)洗脫，但乙醇體積分數(shù)過大，部分吸附雜質(zhì)也會競爭脫附[22]，因此確定洗脫液濃度75%、80%、85%作為響應面因素考察水平。

圖5 洗脫液濃度對洗脫率的影響Fig.5 Effect of eluent concentration on desorption rate

2.5.2 洗脫曲線 圖6為不同洗脫流速下飽和吸附后樹脂的洗脫曲線，從圖6可知，洗脫流速越快，洗脫曲線峰形愈寬、拖尾現(xiàn)象越明顯，且洗脫液消耗增多，而采用體積分數(shù)為80%乙醇溶液以1.0 mL/min流速洗脫時，洗脫曲線單一、對稱、無明顯拖尾，且對目標物的洗脫集中，因此確定最佳洗脫流速為1 mL/min，洗脫液用量140 mL。

2.6 響應面試驗優(yōu)化分析

2.6.1 響應面試驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，進行三因素三水平的 RSM 分析試驗，考察上樣濃度（A）、上樣液pH （B）和洗脫液濃度（C）對毛蕊異黃酮的回收率（Y）影響，結(jié)果見表5。

圖6 不同洗脫流速的洗脫曲線Fig.6 Desorption curve in different flow rates of elution

表5 響應面試驗結(jié)果Table 5 Results of the response surface experiments

2.6.2 響應曲面方差分析 采用多元回歸擬合上述試驗結(jié)果，得到以回收率為目標函數(shù)，各參數(shù)編碼值的二次多項回歸模型：Y=72.10-0.19A-0.10B-0.087C-0.43AB-0.20AC-0.18BC-3.25A2-2.38B2-1.55C2，對其進行顯著檢驗與方差分析，結(jié)果見表6。

表6 響應面方差分析Table 6 Variance analysis of response surface experiment

從表6可知，該回歸模型P＜ 0.01，表明該模型回歸效果顯著，R2=0.9840表明模型擬合值與實際結(jié)果高度相關(guān)，而失擬項P=0.7631＞0.05表明該回歸方程擬合度較高，誤差對試驗結(jié)果影響較小，模型可靠。在所有作用因素中，僅二次項A2、B2、C2對目標化合物的回收率影響極顯著（P＜0.01）。從表中F值可知，各因素對黃芪毛蕊異黃酮的純化影響大小順序為：上樣濃度（A）＞上樣液pH （B）＞洗脫液濃度（C）。

2.6.3 兩因素間的交互作用 圖7為不同因素的交互作用對回收率的影響，響應曲面越陡峭，表明該因素對回收率的影響越大[23]，從圖7可知，回收率的響應曲面開口朝下，與三個影響因素均呈明顯二次拋物關(guān)系，且隨著上樣濃度、上樣液pH和洗脫液濃度的增大，回收率逐漸升高，并出現(xiàn)極大值，隨后呈不同斜率的下降，另從方差分析結(jié)果與響應曲面觀察可知，AB曲線變化最為密集陡峭，其次為AC，影響最小為BC。

圖7 兩因素交互影響回收率的響應曲面Fig.7 Response surface of the recovery rates affected by two-factor

2.7 驗證試驗

利用Design-Expert 8.0軟件對二次拋物線函數(shù)模型進行極值分析，得到HPD-400大孔樹脂純化毛蕊異黃酮提取物的最佳工藝條件：體積為60 mL，濃度為2.97 mg/mL，pH為4.9的毛蕊異黃酮提取液以1 mL/min流速上樣至HPD-400型大孔樹脂后，經(jīng)體積分數(shù)為79.8%乙醇溶液，以1 mL/min流速洗脫，對毛蕊異黃酮的理論回收率為72.9%，實際回收率為73.2%，與模型預測值較接近，表明該二次多項回歸模型可預測各因素與響應值間的影響關(guān)系。純化后樣品溶液的色譜圖，見圖8所示，產(chǎn)物中目標化合物的含量由2.17%提高至10.36%，約為純化前4.8倍。

圖8 純化前后樣品色譜圖Fig.8 Chromatograms of sample solution before (a)and after (b) purification

3 結(jié)論

由于黃芪毛蕊異黃酮提取物中存在的色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，可能影響其活性作用，因此以黃芪毛蕊異黃酮提取物為原料，通過比較不同類型樹脂的靜態(tài)吸附-洗脫性能，篩選出合適樹脂后，采用單因素實驗與三因素三水平響應面試驗，確定大孔樹脂純化黃芪毛蕊異黃酮的最佳工藝條件為：體積為60 mL，濃度為2.97 mg/mL，pH為4.9的毛蕊異黃酮提取液以1 mL/min流速上樣至HPD-400型大孔樹脂后，經(jīng)體積分數(shù)為79.8%乙醇溶液，以1 mL/min流速洗脫，產(chǎn)物中毛蕊異黃酮的含量由2.17%提高至10.36%，約為純化前4.8倍，該純化工藝操作簡便，目標化合物回收率較高，適于推廣使用。