高粱烏米對小鼠腸道菌群結構的調控作用

李菁菁，韓姣姣，石秋月，陳 菊，蘇秀榕

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315832；2.寧波大學食品與藥學學院，浙江寧波 315832）

高粱烏米又稱高粱黑粉菌（Sphacelotheca sorghiLink），是一種真菌，是高粱感染了黑穗病菌的發病穗體，具有良好的營養價值和藥用價值[1]。高粱烏米含有多種營養成分，如蛋白質、維生素、多糖、礦物質等，是一種天然的營養、保健和藥用食品。歐美國家把高粱烏米作為可食用菌類[2]。古人早已發現了烏米的高效藥用價值，東北人民有食用高粱烏米的習慣，甚至有養豬的農民發現給豬喂食高粱烏米可有效地緩解豬的腸道疾病[3]。目前，國內對高粱烏米的功能性方面研究還較少，僅有少量的種植、保鮮以及貯藏等方面的研究。

在人類進化過程中，腸道微生物一直發揮著很重要的作用，它們和人體的營養吸收、物質代謝以及健康免疫等具有直接關系，跟隨著人類不斷進化[4]。研究發現，腸道微生物與人類是互利共生的關系，宿主為其提供營養物質和繁殖場所，而它們影響著宿主的物質吸收與代謝，對宿主保持健康、抵御疾病發揮著重要的作用[5]。目前高通量測序技術已經是研究菌群多樣性的新手段[6-7]。16S rDNA為編碼原核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，具有10個保守區域和9個高變區域（V1-V9），其中保守區在細菌間差異不大，高變區具有屬或種的特異性[8]。鑒于此，本研究采用高通量測序技術系統性研究高粱烏米對小鼠腸道菌群的作用，為預防疾病、增強體質、合理規劃飲食提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高粱烏米粉 購自吉林省梨樹縣烏米農民專業合作社；ICR雄性小鼠 購自浙江省實驗動物中心（浙江杭州，動物編號：1605200003）；常規飼料 購于寧波大學實驗動物中心；總膽固醇（Total Cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（High-density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白（Low-density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）測定試劑盒 購于南京建成生物工程研究所；E.Z.N.A.? Soil試劑盒 購自上海玉博生物科技有限公司。烏米飼料（基礎飼料與烏米以1:1比例混合） 為實驗室自制。

天平和水浴鍋 寧波江南儀器廠；酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗 24只10周齡的ICR雄性小鼠適應兩周后，隨機分為2組，每組12只：對照組，喂食普通飼料；烏米組，喂食烏米飼料；所有小鼠均為自由飲食。所有的動物實驗均在寧波大學實驗動物中心[SYXK（ZHE 2008-0110）]完成。動物實驗及護理程序都嚴格遵循寧波大學實驗動物中心（隸屬于浙江實驗動物共同服務平臺）制定的指導方針。控制室內溫度（23±1 ℃）和濕度（55%±10%），循環12 h光照/黑暗（燈光）。每周測量一次小鼠體重，8周后處死小鼠。

1.2.2 樣品處理 在處死小鼠之前，收集每只小鼠的糞便并將其保存在-80 ℃，用于之后的16S rRNA基因測序。實驗結束時，各組小鼠禁食、禁水24 h，對小鼠麻醉。眼球取血液存于離心管內，37 ℃水浴10 min，3000 r/min離心后取上層血清，分裝后凍存于-80 ℃冰箱備用。采血結束，脫頸處死小鼠，解剖取出肝臟，需稱重。

1.2.3 臟器指數和血清生理生化指標檢測 肝臟系數計算：肝臟重量/體重（g/g）。取出存放于-80 ℃的血清樣品，按照試劑盒說明書測定血清中 TC、TG、HDL-C、LDL-C，并計算其濃度。

1.2.4 腸道微生物的檢測

1.2.4.1 總DNA提取 按照E.Z.N.A.? Soil試劑盒說明書從小鼠糞便樣品中提取出總基因組DNA，其濃度經NanoDrop 2000測定[9]。

1.2.4.2 16s rRNA基因V3-V4區PCR擴增及高通量測序 基因組樣品由DNA Qubit 2.0進行精確定量后，使用細菌16S rRNA基因的V3-V4區設計引物（正向引物為5’- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，反向引物為5’-GGACTCGTGGGTCTCTAAT-3’）進行擴增。擴增結束后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳將得到的PCR產物進行檢測并切膠回收，精確定量后由Illumina MiSeq進行測序。

1.3 數據處理

利用FLASH軟件根據PE reads之間的overlap關系將成對的reads拼接成一條序列[10]，并去除barcode序列，通過Prinseq軟件去除短于50 bp的片段和reads尾部質量值在20以下的堿基，過濾低復雜度序列，去除非擴增區域[11]。最后，利用Mothur軟件中的pre.cluster算法進行測序錯誤校正，同時利用chimeras.uchime算法去除序列中的嵌合體[12]。

利用Uclust軟件對OTU進行聚類分析（屬的序列相似性閾值為0.97，種的序列相似性閾值為0.99），并選擇OTU數目變化與Uclust參數之間最佳similarity值[13]，通過Mothur對α-多樣性包括Chao1指數、Observed_species指數、Shannon指數以及 Simpson指數進行分析[12]，同時基于Unifrac metric計算方法對其β-多樣性指數進行分析[14]。最后采用RDP classifier軟件對處理后的序列進行物種分類、群落變化的分析[15]。

實驗數據采用平均值±標準差的方式表示，符合正態分布的根據單因素方差（ANOVA）進行分析，不符合正態分布的根據圖基事后檢驗法（Tukey’ post hoc test）進行分析。P＜0.05代表具有統計學差異。采用GraphPad Prism7和聯川生物云平臺繪制柱狀圖、Alpha多樣性圖、群落結構圖以及PCoA圖。

2 結果與分析

2.1 表型變化

圖1a顯示了對照組和烏米組的體重，在第8周末，對照組小鼠體重達到34.3±3.23 g，烏米組小鼠體重達到21.65±2.38 g。與對照組相比，烏米組體重和增重量顯著降低（P＜0.01，圖1b）。圖1c為小鼠的肝臟系數變化，對照組的肝臟系數為4.768±0.56 g，烏米組的肝臟系數為5.486±0.79 g，烏米組與對照組之間無顯著性差異（P＞0.05）。肝臟系數是肝臟重量與體重之比。肝臟重量越大，與體重之比就會增大，則表明肝臟可能水腫或增生肥大。結果表明，烏米的膳食補充可以緩解小鼠體重的增加，并且對肝臟沒有造成影響。

2.2 生理生化指標

總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）是檢查血脂的重要指標。血脂水平過高，將引發脂肪代謝異常的高脂血癥，間接引發其他相關疾病。如圖2所示，與對照組相比，烏米組小鼠TC（2.89±0.89 mmol/L）、TG（1.27±0.39 mmol/L）、LDL-C（6.02±0.47 mmol/L）極顯著降低（P＜0.01），HDL-C水平極顯著升高（0.30±0.06 mmol/L，P＜0.01），高血脂的發生常常反應著肥胖問題，這些結果表明食用烏米具有緩解高脂血癥和預防肥胖的功效。

2.3 烏米對小鼠腸道菌群多樣性及結構的作用

為了探究烏米處理對腸道菌群的作用，本研究收集了24只小鼠喂養8周后的糞便樣本，對其V3-V4區進行了高通量測序分析。用observed_species指數表示腸道菌群的豐富度，用shannon指數表示腸道菌群的多樣性。如圖所示，相比于對照組，烏米處理降低了腸道菌群的豐富度（P＜0.01），提高了腸道菌群的多樣性（圖3a、3b）。基于加權主坐標分析（Weighted UniFracPCoA）兩組小鼠腸道菌群的總體組成。結果顯示，烏米可以使腸道菌群的整體組成發生變化，偏離對照組（圖3c）。

2.4 腸道菌群的組成特點

桑基圖（Sankeyplots）用來展示數據的“流動”變化，分支的寬度表示豐度的大小。圖4顯示了不同組別（左側）對應的門水平（中間）和科水平（右側）的菌群相對豐度。基于選擇科水平豐度前十的原則，從對照組和烏米組中篩選出擬桿菌科（Bacteroidaceae）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、棒狀桿菌科（Corynebacterium）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、Muribaculaceae、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）和葡萄球菌科（Staphylococcaceae），其中棒狀桿菌科屬于放線菌門（Actinobacteria），擬桿菌科、Muribaculaceae和理研菌科屬于擬桿菌門（Bacteroidetes），其余6個均屬于厚壁菌門（Firmicutes）。在門水平上（表1），與對照組相比，烏米組中放線菌門（7.44%±0.50%）和厚壁菌門（55.95%±1.59%）極顯著增加，擬桿菌門（16.90%±0.20%）極顯著降低（P＜0.01）。在科水平上，與對照組相比，烏米組中的乳桿菌科（0.45%±0.05%）和Muribaculaceae（9.39%±0.79%）的豐度極顯著降低（P＜0.01），其余菌科豐度均為明顯增加。

圖1 小鼠體重及臟器指數變化Fig.1 Changes of body weight and organ indexs in mice

圖2 小鼠血脂生理生化指標變化Fig.2 Changes of physiological and biochemical index

圖3 各組腸道菌群Alpha多樣性和PCoA分析Fig.3 Gut microbiota Alpha diversity and PCoA analysis

圖4 小鼠腸道菌群門水平和科水平變化趨勢Fig.4 Variation trend on the phylum and family levels of gut microbiota

表1 小鼠腸道菌群在門和科水平上的豐度Table 1 Abundance of gut microbiota at the level of phylum and family in mice

在屬水平上，我們對11個常見細菌屬的豐度進行了分析比較，得到屬水平的氣泡圖如圖5所示。結果顯示，與對照組相比，烏米組中的不動桿菌屬（Acinetobacter）、梭菌屬（Clostridium）、梭狀芽孢桿菌XlVa（Clostridium XlVa）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、乳球菌屬（Lactococcus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和另枝菌屬（Alistipes）等菌屬2倍以上的上調，巴氏桿菌（Barnesiella）和乳桿菌屬（Lactobacillus）等菌屬2倍以上的下調。結果表明，烏米可以使小鼠腸道中的屬菌群豐度發生改變，增加了產生短鏈脂肪酸（SCFAs）菌屬的豐度。

圖5 小鼠腸道菌群屬水平的OTU氣泡圖Fig.5 OTU bubble plot on the genus level of gut microbiota

在種水平上，對照組和烏米組中的Kineothrixalysoides、解糖梭菌（Clostridium saccharolyticum）、Muribaculumintestinale和變異棒桿菌（Corynebacterium variabile）的豐度占比如圖6所示。與對照組相比，烏米組中Muribaculumintestinale的豐度從58.92%±0.36%降低至9.24%±0.46%，解糖梭菌的豐度從0.58%±0.01%增加到1.01±0.06%，Kineothrixalysoides的豐度1.78%±0.24%增加到10.88%±0.65%。在對照組中沒有變異棒桿菌，烏米組中的變異棒桿菌豐度為4.71%±0.30%（P＜0.01）。結果表明，烏米可以增加小鼠腸道中的益生菌，減少致病菌的豐度。

3 討論

烏米可以減輕小鼠體重，降低血清中的TC、TG、LDL-C 水平和提升HDL-C水平，通過調節機體對脂肪的代謝能力從而實現減輕體重。

圖6 小鼠腸道菌群種水平分布Fig.6 Horizontal distribution of gut microbiota in mice

喂食烏米改變了小鼠腸道菌群的結構。在門水平，烏米可增加小鼠腸道中的放線菌門和厚壁菌門的豐度，減少擬桿菌門的豐度。有研究表明，放線菌門可以產生抗菌劑、抗癌物質、免疫抑制劑和植物生長激素等豐富的生物活性次級代謝產物[16-19]，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和促進生長等作用，目前被認為是天然藥物的主要來源[20]。此外，有研究表明，擬桿菌門參與碳水化合物的轉化，分解為更多的葡萄糖，積累過多就會轉化為脂肪從而形成肥胖[21-22]。烏米可以使小鼠腸道菌群中的梭菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、瘤胃球菌屬和不動桿菌屬等產SCFAs的菌屬豐度增加。研究表明腸道細菌產生的SCFAs，尤其是丁酸，可促進調節性T細胞的發育，增強杯狀細胞的粘液產生，從而增強粘膜屏障[23]。另一方面，腸道內SCFA水平升高，保護腸上皮屏障受損，減少腸內毒素以及減少炎癥反應的產生，防止因炎癥而造成的肝臟受損，從而改善脂質代謝，減少肥胖。烏米處理使小鼠腸道菌群中的Muribaculumintestinale豐度顯著降低，Kineothrixalysoides和變異棒桿菌豐度顯著升高。有研究表明，Muribaculumintestinale在大腸腫瘤和胃癌等腸道疾病中檢出增加[24-25]，在腸道菌群由于多種原因導致平衡發生變化會導致疾病[26]。Kineothrixalysoides屬于人類腸道微生物最豐富家族之一中的Lachnospiracae家族，可以產生很多丁酸[27]。丁酸也是一種短鏈脂肪酸，與免疫穩態、預防代謝性疾病以及改善生活質量和減少抑郁有關[28-29]，對腸道健康至關重要。

綜上所述，烏米可以減輕體重，預防血脂疾病，可以通過調節腸道菌群預防肥胖、減少腸內毒素以及減少炎癥的發生從而對機體產生有益影響。

4 結論

本研究通過分析小鼠喂食高粱烏米后的體重、血清生理生化指標的變化，以及利用高通量測序技術分析腸道微生物的多樣性、群落組成以及結構的變化發現，烏米可以減輕體重，預防血脂疾病，可以通過調節腸道菌群預防肥胖、減少腸內毒素以及減少炎癥的發生而對機體產生有益影響。