5種金屬離子對紫色紅曲霉主要次生代謝物譜的調節作用

黃勝男，高夢祥，劉應保

（長江大學生命科學學院，湖北荊州 434025）

紅曲霉（Monascus）可以產生多種次生代謝物，其中研究最多的是紅曲色素（Monascuspigment，MP）、莫納克林K（Monacolin K，MK）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和麥角固醇等有益代謝物[1]。紅曲霉的有益代謝物主要用于食品著色和醫療保健等領域，比如紅曲色素具有著色和抗氧化、抗炎癥、抗癌等功能，莫納克林K、γ-氨基丁酸具有降血脂、降血壓、降血糖和抗癌等功效[2]。此外，紅曲霉還產生一種真菌毒素桔霉素（Citrinin，CTN），因其具有腎毒性而嚴重影響了紅曲霉上述代謝物的開發應用。不過學術界從菌種培育和改造、優化發酵環境等方面，輔以理化和分子生物學手段可將其在發酵過程中控制在安全范圍內[3-6]。其中，培養基的化學組成，尤其是金屬離子不僅能顯著影響次生代謝物的合成，而且還能激活沉默的或隱蔽的次生代謝物的合成[7-9]。

除了作為營養成分，金屬離子還對微生物的次生代謝合成具有重要的調節作用。關于金屬離子對紅曲霉次生代謝物的調節作用，已有不少報道。在紅曲霉（Monascussp.ZK、ZH、S、M.anka、M.purpureusNIIS）的研究中發現，Zn2+可以顯著提升紅曲色素的合成[10-13]。相反，Zn2+則抑制M.purpureusATCC 16365紅曲色素的合成[14]。適量的Mn2+、Mg2+均能促進M.sp S和M.anka黃色素的合成[11-12]，而Fe2+則抑制M.sp S紅曲色素的合成[12]。然而，在M.rubber和M.purpureusATCC 16365中，Fe2+則可以促進紅曲色素的合成[14-16]。在M.FJ3中Na+、Fe2+、Cu2+和Mn2+可以協同促進黃色素的產量，而對桔霉素沒有影響[17]。相反，Cu2+則抑制M.anka、M.rubber紅曲色素的合成[15-16,18]。對于MK而言，適量的Zn2+可以促進紅曲霉MK的合成[19-21]。Mg2+能促進紅曲霉桔霉素的合成[4]，而Na+則抑制桔霉素的合成[22]。而金屬離子對紅曲霉其他次生代謝產物的研究則鮮有報道。

從上述的研究結果中可以發現，一些研究結論截然相反。可能原因在于，金屬離子對紅曲色素的調控作用存在菌種特異性和菌株特異性，同時存在劑量效應，不當的劑量則對次生代謝物合成不具有正調節作用，甚至是負效應[9]。此外，在不同的培養條件（培養基成分、培養容器和培養環境等）下，金屬離子對次生代謝物的調節作用不同[9,23]。而且，多數研究僅關注于金屬離子對紅曲霉的某個代謝物的效應，而很少對多個代謝物同時進行觀察。基于此，本研究以紫色紅曲霉為研究對象，采用實驗室常用的馬鈴薯葡萄糖培養基，通過5種金屬離子處理，結合金屬離子螯合實驗，揭示不同離子對紫色紅曲霉主要次生代謝物譜的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲霉（Monascus purpureus） 本實驗菌種；乙醇、甲酸、甲苯、乙酸乙酯、苯、8-羥基喹啉和金屬離子等試劑 均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（Potato Dextrose Broth，PDB）：200 g去皮土豆，20 g葡萄糖，加去離子水煮沸20～30 min，經紗布過濾后濾液補加去離子水至1000 mL，121 ℃滅菌20 min；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato Dextrose Agar，PDA）：在PDB基礎上加15 g瓊脂粉；查氏酵母膏瓊脂（Czapek yeast exatract agar，CYA）：1.0 g K2HPO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KCl，3.0 g NaNO3，0.01 g FeSO4·7H2O，30 g蔗糖，5.0 g酵母粉，15 g瓊脂，加去離子水攪拌，煮沸后加去離子水至1000 mL，分裝至錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。

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1.2 實驗方法

1.2.1 紅曲霉孢子培養 將保存的菌種接到CYA培養基斜面上，30 ℃培養5～7 d，用適量去離子無菌水洗斜面，將液體過濾到含玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩打散孢子液后，采用血球計數板法計算孢子數。

1.2.2 金屬離子處理方法 固體培養：取PDA培養基，高溫融化后，分別添加不同濃度的ZnSO4、MnCl2、MgSO4、CuSO4、CoCl2等金屬離子，制作固體平板，待其凝固后，點接紫色紅曲霉孢子。倒置放于30 ℃恒溫培養箱培養，培養8 d后，拍照。

液體培養：取PDB培養基，分別添加不同濃度的ZnSO4、MnCl2、MgSO4、CuSO4、CoCl2等金屬離子，不加金屬離子的為對照，然后分別接種紫色紅曲霉孢子（1×104個/mL），放于30 ℃，200 r/min的恒溫搖床培養。

1.2.3 金屬離子螯合實驗 固體培養：方法同1.2.2，制備含不同濃度的8-羥基喹啉（0、10、20 μmol/L）的固體平板，培養后觀察、拍照。

液體培養：方法同1.2.2，不同濃度的8-羥基喹啉（0、10、20 μmol/L），然后分別接種紫色紅曲霉孢子恒溫搖床培養。

1.2.4 次生代謝產物的測定 紅曲色素的測定：測定方法參照文獻[22]，將發酵液連同菌體一起勻漿，取適量的勻漿液于60 ℃萃取1 h后，離心取上清即為水溶總色素；取300 μL勻漿液，加入700 μL無水乙醇，于60 ℃萃取1 h后，離心取上清即為醇溶總色素。然后用紫外分光光度計在410、46、500 nm下測得OD值，色素含量（U/g）=OD×稀釋倍數（U）/生物量（g）。

莫納克林K的測定：測定方法參照文獻[22]，將發酵液連同菌絲體用高速勻漿機搗碎后取500 μL勻漿液，加入等體積的乙酸乙酯劇烈震蕩后高速冷凍離心，取上清放真空干燥箱中干燥，加入0.5 mL苯除雜，放置60 ℃烘箱烘干，加入1 mL 95%乙醇溶解，用紫外分光光度計在238 nm處測吸光值。根據標準品制作的標準曲線方程y=0.051x+0.003，計算其含量（mg/L）。

桔霉素的測定：測定方法參照文獻[22]，取發酵液上清，加入等體積萃取劑（甲苯:乙酸乙酯:甲酸=7:3:1，V:V:V），劇烈震蕩后，離心取最上層，用0.45 μm有機溶劑濾膜過濾后采用HLPC測其濃度。使用的柱子為C18（5 μm，250 mmol/L×4.6 mmol/L）。檢測條件：流動相為乙腈（色譜純加入0.05%的三氟乙酸）：超純水（加入0.05%三氟乙酸）=3:1，使用二極管陣列檢測器（Agilent），流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，在330 nm波長下檢測桔霉素含量。根據標準品制作的標準曲線方程y=66.456x+45.782，計算其含量（mg/L）。

γ-GABA的測定：測定方法參考文獻[24]，將發酵好的菌體烘干，充分研磨成粉末，準確稱取一定量的粉末溶解于適量的蒸餾水，搖勻后超聲提取1 h（20 kHz、90 W、30 ℃），2400×g，離心15 min，取上清1 mL，用紫外分光光度計在640 nm處測定其吸光值，并代入回歸方程算出濃度，計算菌體γ-GABA的產量（mg/g）。產量（mg/g）=濃度×稀釋倍數/菌體質量。

生物量的測定：測定方法參照文獻[22]，將發酵液收集到離心管中離心（9600×g，10 min），收集沉淀，用去離子水洗滌沉淀3遍后，將其置于60 ℃烘箱烘至恒重（g）。

1.3 數據處理

實驗數據采用軟件Graphpad prism 8.01進行作圖及統計分析，以mean±SD表示計量資料，組間分析采用multiple t tests-one per row方法。所有實驗均重復操作三次。

2 結果與分析

2.1 Cu2+對紫色紅曲霉生長和次生代謝的影響

固態培養條件下，隨著CuSO4濃度（1、2、5 mmol/L）的增加，紫色紅曲霉的生長逐漸受到抑制（圖1），5 mmol/L時對菌體生長抑制最明顯，氣生菌絲明顯減少。而不同濃度的CuSO4均能明顯改變紫色紅曲霉的色素合成（圖1），與對照相比，CuSO4處理的菌體顏色明顯加深，表明色素含量高。即CuSO4能顯著刺激紫色紅曲霉色素合成，且高濃度情況下明顯抑制菌體生長。

圖1 不同濃度的CuSO4對紫色紅曲霉固態培養時生長和色素合成的影響Fig.1 Influence of CuSO4 on growth and pigments of M.purpureus in solid-state fermentation(SSF)

在液體培養條件下，CuSO4（0.5、1、2、5 mmol/L）對紫色紅曲霉生長和次生代謝的影響與固態培養的結果差異懸殊（圖2）。在低濃度下，CuSO4對紫色紅曲霉的生長無影響（圖2a），而在高濃度（2、5 mmol/L）時，則完全抑制菌體生長。低濃度的CuSO4（0.5 mmol/L）能顯著刺激紅曲色素的合成（圖2b、圖2c），其中水溶紅（OD500）、橙（OD465）、黃（OD410）色素產量分別提高了2.01、2.07和1.73倍，差異極顯著（P＜0.01）；醇溶紅、橙、黃色素產量分別提高了2.83、1.74和1.95倍，差異顯著（P＜0.05）。相對于對照，CuSO4（0.5、1 mmol/L）處理，導致莫納克林K產量分別提升了1.78和1.58倍（圖2d），差異顯著（P＜0.05）。對于真菌毒素桔霉素而言，CuSO4（0.5、1 mmol/L）對其合成的促進效果最為顯著，相較于對照，處理組的桔霉素含量分別提高了5.53和2.61倍（圖2e）。然而，與上述代謝物相反的是，γ-氨基丁酸（GABA）的合成則被CuSO4（0.5、1 mmol/L）嚴重抑制，其產量分別下降了81.5%和62.7%（圖2f）。上述結果表明，Cu2+對紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的合成具有明顯刺激作用，而對GABA合成則存在強烈抑制效應。

2.2 Zn2+對紫色紅曲霉生長和次生代謝的作用

與CuSO4的效應類似，隨著ZnSO4濃度（0.5、1、5 mmol/L）的增加，紫色紅曲霉的生長逐漸受到抑制（圖3），5 mmol/L時對菌體生長抑制最明顯。對于次生代謝物紅曲色素的合成，ZnSO4具有明顯的促進效應。

ZnSO4（0.25、0.5 mmol/L）對液態培養條件下紫色紅曲霉生長和次生代謝合成的作用也類似于CuSO4，低濃度下對菌體生長無顯著影響（圖4a）。對于次生代謝物而言，高濃度ZnSO4（0.5 mmol/L）對紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的合成具有強烈的刺激作用。其中，水溶紅、橙、黃色素的產量較對照菌分別提高了93.3%、78.6%、57.6%，差異顯著（P＜0.05）（圖4b）；醇溶紅、橙、黃色素產量分別提高了3.9、2.54和1.54倍（圖4c）。相對于對照，ZnSO4（0.5 mmol/L）處理導致莫納克林K和桔霉素的產量分別提升了92.2%和6.91倍（圖4d、圖4e），差異顯著（P＜0.05）。同樣，ZnSO4也顯著（P＜0.05）抑制GABA的合成，高濃度條件下抑制效應更明顯（圖4f）。綜上所述，高濃度Zn2+顯著（P＜0.05）促進紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的合成，嚴重抑制GABA的合成。

圖2 CuSO4（mmol/L）對紫色紅曲霉液態培養時生長和次生代謝物合成的影響Fig.2 Influence of CuSO4 on growth and secondary metabolite of M.purpureus in submerged fermentation (SMF)

圖3 ZnSO4對固態培養時紫色紅曲霉生長和色素合成的作用Fig.3 Influence of ZnSO4 on growth and pigments of M.purpureusin SSF

2.3 Mg2+調控紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成

MgSO4處理的結果表明，0.25 mmol/L濃度可以促進紅曲霉的氣生菌絲生長，而高濃度（0.5 mmol/L）條件對菌絲生長具有一定抑制作用（圖5，正面）。同時，MgSO4處理能加深菌體顏色（圖5，反面），相對于對照菌，處理的菌體呈深紅色，表明MgSO4促進了紅曲色素的合成。

MgSO4（0.25、0.5 mmol/L）對液態培養條件下紫色紅曲霉生長無顯著影響（圖6a）。對于次生代謝物而言，MgSO4（0.5 mmol/L）對紅曲色素、莫納克林K合成具有強烈的刺激作用。其中，水溶紅、橙、黃色素的產量較對照菌分別提高了2.68、2.25和2.02倍，差異顯著（圖6b）（P＜0.05）；醇溶紅、橙、黃色素產量分別提高了1.26、1.23和1.82倍（圖6c）。低濃度MgSO4（0.25 mmol/L）可顯著促進水溶色素的合成，分別提高了1.04、1.05和1.01倍。相對于對照，MgSO4（0.5 mmol/L）處理導致莫納克林K產量提升了51.8%（圖6d），差異顯著（P＜0.05）。低濃度MgSO4能顯著提升桔霉素的產量，相對于對照，其產量增加了1.79倍（圖6e）。同樣，MgSO4也明顯抑制GABA的合成，高濃度條件下抑制效應更明顯（圖6f）。綜上所述，適宜濃度的Mg2+能顯著（P＜0.05）促進紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的合成，而高濃度Mg2+則嚴重抑制GABA的合成。

圖4 ZnSO4（mmol/L）對態培養時紫色紅曲霉液生長和次生代謝物合成的作用Fig.4 Influence of ZnSO4 on growth and secondary metabolite of M.purpureus in SMF

圖5 MgSO4對固態培養條件下紫色紅曲霉生長和色素合成的作用Fig.5 Influence of MgSO4on growth and pigments of M.purpureus in SSF

2.4 Mn2+對紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成的調控作用

從圖7可以看出，相對于對照菌，MnCl2可以促進紅曲霉的氣生菌絲生長，高濃度MnCl2（5 mmol/L）對菌絲生長無抑制作用（圖5，正面）。同時，MnCl2處理導致紅曲色素產量增加（圖5，反面）。

圖8的數據表明，MnCl2（0.5、1 mmol/L）對紫色紅曲霉生長無明顯抑制作用（圖8a）。對于水溶紅曲色素有一定的刺激作用（圖8b），但不顯著（P＞0.05），而MnCl2（0.5 mmol/L）可以顯著刺激醇溶色素的合成，相對于對照組，醇溶紅、橙、黃色素產量分別提高了131.1%、83.6%和49.2%（圖8c）。而MnCl2（0.5、1 mmol/L）處理則顯著促進莫納克林K和桔霉素的合成。其中，0.5 mmol/L的MnCl2導致莫納克林產量較對照組提高了2.01倍（圖8d）；MnCl2（0.5、1 mmol/L）使桔霉素的產量則分別增加了39.6%和92.3%（圖8e）。高濃度MnCl2處理則導致GABA的產量降低，相對于對照降低了61.1%，而僅在高濃度MnCl2處理時，差異顯著（P＜0.05）。即MnCl2處理的數據表明，低濃度Mn2+（0.5 mmol/L）顯著促進醇溶紅曲色素的合成，高濃度Mn2+（1 mmol/L）導致GABA產量顯著（P＜0.05）降低；而Mn2+（0.5、1 mmol/L）則顯著（P＜0.05）刺激莫納克林K和桔霉素的合成。

圖6 MgSO4（mmol/L）對態培養時紫色紅曲霉液生長和次生代謝物合成的作用Fig.6 Influence of MgSO4 on growth and secondary metabolite of M.purpureus in SMF

圖7 MnCl2對固態培養條件下紫色紅曲霉生長和色素合成的作用Fig.7 Influence of MnCl2 on growth and pigments of M.purpureusin SSF

2.5 Co2+對紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成的影響

與上述金屬離子的效應不同的是，CoCl2（0.5、1、5 mmol/L）嚴重抑制固態培養時的紫色紅曲霉的生長，該抑制效應具有明顯的劑量效應，5 mmol/L時紅曲霉無法生長（圖9，正面）。同時，CoCl2也抑制紅曲色素的產量（圖5，反面）。

同固態培養的結果相似，CoCl2（0.5、1 mmol/L）顯著（P＜0.05）抑制液態培養時紫色紅曲霉生長（圖10a），生物量分別降低了47.9%和53.7%。次生代謝產物的測定結果發現，CoCl2（0.5、1 mmol/L）可以顯著刺激醇溶色素的合成，相對于對照，醇溶紅、橙、黃色素產量分別提高了4.04、5.04、2.63倍和3.08、3.41、2.7倍（圖10c），差異顯著（P＜0.05）。而高濃度CoCl2（1 mmol/L）顯著抑制水溶色素和莫納克林K的合成，相對于對照組，水溶紅、橙、黃色素產量分別降低了69.7%、65.7%和64.4%（圖8b）；而莫納克林K產量降低不顯著。CoCl2（0.5、1 mmol/L）則幾乎完全抑制桔霉素合成，從峰面積可以看出，桔霉素合成嚴重受阻（圖10e）。同樣，CoCl2（0.5、1 mmol/L）也嚴重抑制GABA的合成，相對于對照，其產量分別降低了92.7%和74.5%。這些表明，Co2+對紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成具有強烈的負調控效應。

2.6 金屬離子螯合劑對紫色紅曲霉生長和次生代謝物的作用

圖8 MnCl2對態培養時紫色紅曲霉液生長和次生代謝物合成的作用Fig.8 Influence of MnCl2on growth and secondary metabolite of M.purpureus in SMF

圖9 CoCl2顯著抑制固態培養條件下紫色紅曲霉生長和色素合成Fig.9 Inhibitory effect of MnCl2 on growth and pigments of M.purpureusin SSF

固態培養的結果發現，金屬離子螯合劑8-羥基喹啉在高濃度下（60 μmol/L）可以完全抑制紫色紅曲霉的生長（圖片未顯示），而在低濃度（10、20 μmol/L）下，對菌體生長無明顯影響，且對色素合成有一定的抑制作用（圖11）。

液態培養的結果表明，HQ對紫色紅曲霉生長具有抑制效應，相對于對照，20 μmol/L條件下迫使紫色紅曲霉生物量下降了26.9%，差異顯著（P＜0.05）。其次，HQ（10、20 μmol/L）對于次生代謝物的合成具有不同的效應。高濃度HQ（20 μmol/L）顯著（P＜0.05）抑制水溶色素合成，與對照相比，其水溶紅、橙、黃色素分別降低了40.6%、34.3%和26%（圖12b）。而醇溶色素合成則被HQ刺激（圖12c），HQ（10、20 μmol/L）處理導致醇溶紅、橙、黃色素分別提高了1.72、1.19、0.8倍，和1.91、1.59、0.76倍。對于莫納克林K而言，低濃度HQ具有促進效應，高濃度無影響。低濃度HQ使得莫納克林K的產量升高了1倍（圖12d）。HQ對桔霉素和GABA的合成具有顯著的抑制作用，其中高濃度HQ的抑制作用最強（圖12e、圖12f）。實驗結果表明，高濃度HQ對紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成具有抑制作用。

2.7 金屬離子及螯合劑對紫色紅曲霉次生代謝物譜的影響

紫外分光光度計波譜掃描（200～600 nm）的結果顯示（圖13），相對于對照，金屬離子顯著改變了紫色紅曲霉的主要次生代謝物譜，未見其他新代謝物。表明金屬離子處理調節紫色紅曲霉主要次生代謝物產量的變化，未改變代謝物種類。

圖10 CoCl2抑制液態培養時紫色紅曲霉液生長和次生代謝物合成Fig.10 Inhibitory effect of CoCl2 on growth and secondary metabolite of M.purpureus in SMF

圖11 8-羥基喹啉對固態培養條件下紫色紅曲霉生長和色素合成的影響Fig.11 Influence of 8-Hydroxyquinoline(HQ) on growth and pigments of M.purpureusin SSF

3 討論

金屬離子作為必要的營養元素，參與微生物的生長和代謝，而金屬離子調節微生物次生代謝合成的機制主要包括以下幾個方面[9]：作為輔因子或激活劑調控次生代謝物關鍵酶的活性或合成基因的表達。Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+是次生代謝合成關鍵酶（氧化酶、加氧酶、抗氧化酶等）的輔因子，在細胞水平和分子水平對真菌生長及真菌毒素的合成具有調節效應。Cu2+對于青霉素的合成、白色念珠菌（Canidia albicans）等真菌的形態發育至關重要，同時還能促進內生真菌（Paraphaeosphaeriaquadriseptata）莫納克林I的合成。Cu2+和Mn2+、Zn2+等離子能刺激串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）萘醌的合成。Mn2+抑制畸形素和白霉素的合成，促進棒曲霉素的合成。真菌毒素的合成高度依賴于可用的Zn2+濃度。鐮刀菌酸、黃曲霉毒素、赭曲霉素和桔霉素等真菌毒素的合成受Zn2+井然有序的調控。Zn2+還通過調控關鍵酶LovD、LoV活性刺激洛伐他汀（莫納克林K）的合成；刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生，誘發氧化脅迫，進而刺激具有抗氧化功能的次生代謝物（色素、類胡蘿卜素、真菌毒素及其他聚酮化合物等）合成，維持氧化還原平衡。Co2+和其他金屬離子一樣，可以導致大量ROS產生，反而會刺激抗氧化功能的次生代謝物比如色素、真菌毒素的合成，以發揮自由基清除能力，這種策略在產色素霉菌中屢見不鮮；作為信號分子，啟動或激活次生代謝物合成。Cu2+還可以作為信號分子激活尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumZZF51）的鐮刀菌酸的合成。真菌次生代謝物合成的啟動和調控依賴于精確的Zn2+濃度，比如雜色曲霉素A、交鏈孢酚、棒曲霉素等聚酮化合物的合成啟動需要精準的微摩爾級Zn2+調控；參與初級代謝進而影響次生代謝合成。

圖12 8-羥基喹啉（μmol/L）對固態培養條件下紫色紅曲霉生長和次生代謝物合成的影響Fig.12 Influence of 8-hydroxyquinoline(HQ) on growth and secondary metabolite of M.purpureus in SSF

圖13 紫色紅曲霉發酵液波譜掃描圖Fig.13 Spectral scanning of fermented broth of M.purpureus

紫色紅曲霉產生的紅曲色素、莫納克林K和桔霉素都是聚酮化合物，三者具有相同的合成前體單元，比如乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A等。乙酰輔酶A在羧化酶作用下產生丙二酰輔酶A，而Mg2+正是乙酰輔酶A羧化酶的輔因子，參與調控各種次生代謝物的合成[9,25]。Mg2+可能通過影響此酶活性進而對紫色紅曲霉的上述代謝物的合成進行調控。上述中間體在各自代謝物生物合成酶催化下依次合成，其中，上述2種前體和中鏈脂肪酸在聚酮合酶等酶催化下最終合成各種紅曲色素[5]。而Mn2+對脂肪酸的合成具有重要的調控作用[9]，這可能是Mn2+促進紅曲色素合成的一個原因。上述3種聚酮化合物利用相同的合成前體，利用各自的合成基因簇編碼各種酶，有序地催化每一個合成步驟。在每個基因簇內都有一個轉錄激活因子，比如PigR、MoH和CtnR分別負責調控各自簇內基因的表達，最終控制紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的產量。而PigR、MoH和CtnR3個轉錄激活因子在結構上都存在Zn2Cys6鋅指簇DNA結合結構域[26-28]。Zn2+則是這些鋅指蛋白發揮轉錄調控的關鍵，因此，Zn2+刺激3種聚酮化合物的合成，可能與此有關。此外，金屬離子超載，都會導致胞內ROS水平激增，進而誘發氧化脅迫[9]，而過多的ROS會刺激包括紅曲色素、莫納克林K及毒素桔霉素在內的具有抗氧化功能的代謝物合成，進而清除ROS，維持胞內氧化還原平衡。本研究所用離子均具有氧化還原平衡功能，其中Mg2+、Zn2+、Mn2+和Mn2+還是超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）等抗氧化酶的輔因子。因此，金屬離子可能通過影響抗氧化酶活性介入氧化還原平衡，并以此對紅曲色素、莫納克林K和桔霉素的合成進行調控。Co2+通過間接作用負責能量物質的合成，通常對色素合成發揮負調控效應，當然還與其濃度過高有關[9]。對于GABA而言，高濃度的金屬離子都具有抑制效應，或許過量的金屬離子破壞了其合成酶谷氨酸脫羧酶的活性[29]，進而導致其產量下降。關于上述金屬離子對紫色紅曲霉的主要次生代謝合成的調控機制，有待下一步實驗驗證。

4 結論

本研究通過金屬離子（Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+）脅迫，結合金屬離子螯合實驗，考察了不同金屬離子對紅曲霉生長和主要次生代謝物譜的調控作用。發現高濃度的金屬離子對紫色紅曲霉生長具有不同程度的抑制作用，而且液體培養的抑制效果遠超過固體培養，其中Co2+的抑制效應最顯著。金屬離子（Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+）在適宜濃度下均能刺激MP、MK和CTN的合成，而Co2+則普遍抑制上述次生代謝物的合成。其次，高濃度的金屬離子均對GABA的合成具有抑制效應。金屬離子螯合實驗發現，HQ處理導致水溶MP、MK、CTN、GABA產量發生不同程度的降低，并對菌體生長具有明顯的抑制效應，佐證了金屬離子對上述代謝物的調控作用。發酵液的波譜掃描表明，金屬離子對代謝物種類并無顯著影響。研究結果將為進一步揭示金屬離子調控紅曲霉次生代謝合成的內在機制奠定基礎。