益生菌植物乳桿菌G1-28復合凍干發酵劑制備及保藏條件研究

李大鵬，高玉榮

（巢湖學院化學與材料工程學院，安徽合肥 238000）

益生菌是一類有益于機體的活性微生物，攝入一定量的活性益生菌有助于調節宿主腸道的微生態平衡，從而有益于宿主健康[1]。植物乳桿菌是目前被廣泛關注的益生菌，普遍存在于果蔬的表面，具有很強的發酵產酸能力[2]。同時研究表明植物乳桿菌具有較強的耐受人體胃腸道內不良環境的能力，容易定植在人體腸道中生長代謝產生乳酸等成分，競爭性抑制腸道內有害微生物，從而有助于防治腸道疾病[3]。益生菌經培養后制備的液體菌劑，存在運輸成本高、菌體失活速度快等缺點，制備易于保存的益生菌粉末狀制劑已成為目前國內外研究的熱點[4]。

真空冷凍干燥，也稱升華干燥，是將原材料冷凍后在真空下使冰升華而使物料干燥的方法[5]。通過在微生物菌懸液中添加保護劑，可減少真空冷凍干燥過程中對菌體的傷害[6]。研究表明，采用真空冷凍干燥進行菌體的保藏，具有細胞存活率高，保藏時間長的特點，已成為菌體干粉制備最常用的方法之一[7]。由于凍干過程中使用的保護劑的類型及其作用原理不同，對于菌體的凍干過程，保護劑的選擇及其復配是研究的重點內容[8]。蔣文鑫等[9]研究了不同分子質量糖（醇）類及蛋白類保護劑對短雙歧桿菌凍干存活率的影響，結果表明山梨糖醇、棉子糖與膠原蛋白以質量比3:3:2時保護效果最好，短雙歧桿菌的凍干存活率可達80%。牛春華等[10]研究了嗜酸乳桿菌凍干保護劑，結果表明可溶性淀粉18%，低聚木糖12%，谷氨酸鈉7%，菊糖15%時，嗜酸乳桿菌細胞存活率最高可達87.4%。王桃等[11]研究優化長雙歧桿菌DD98的凍干保護劑配方，在脫脂奶粉10%，海藻糖20%，Vc-Na 2%，純化水68%的條件下凍干菌粉的存活率提高到90%。

目前，嗜酸乳桿菌等益生菌的凍干存活率普遍不高，為了提高益生菌的凍干存活率，提高益生菌的保藏效果，本文以前期從傳統臘腸中篩選的具有體外降膽固醇和降甘油三酯功能的益生菌植物乳桿菌G1-28為研究對象，對菌體離心條件、凍干保護劑的選擇及其復配及其凍干菌劑的保藏條件進行了系統的研究，為益生菌植物乳桿菌G1-28高活性凍干發酵劑的制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌G1-28 從傳統臘腸中篩選的具有體外降膽固醇和降甘油三酯功能的乳酸菌，巢湖學院食品工程實驗室保藏[12]；脫脂乳蒙牛牌 市售；甘油、海藻糖、山梨醇 北京奧博星生物技術有限責任公司。

TG16Ws臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；SHP-160智能生化培養箱 上海三發科學儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州市智拓凈化設備科技有限公司；LGJ-30F真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌菌種擴大培養 將-20 ℃保藏的植物乳桿菌G1-28的甘油管融化，取1 mL接種到裝有50 mL MRS液體培養基中，30 ℃靜置培養14～16 h，無菌生理鹽水離心洗滌3次，用無菌水將菌懸液調至適宜濃度備用[13]。

1.2.2 植物乳桿菌菌懸液離心條件的選擇 將植物乳桿菌G1-28菌體100 mL培養液移入無菌離心管中，分別在3000、4000、5000、6000 r/min下離心10和20 min；棄去上清液，收獲菌體，生理鹽水洗滌后用于活細胞計數[14]。

1.2.3 植物乳桿菌凍干保護劑的確定 將經過培養和離心收集制備的植物乳桿菌G1-28的菌泥，測定細胞的活菌數N0，按照保護劑:菌泥為（w/v）2:1進行配比，利用渦旋混合器充分混勻后分裝，在-40 ℃下預凍6 h，在真空度0.09 MPa，冷阱溫度-51 ℃的條件下進行真空冷凍干燥22～24 h[11]。凍干后將凍干瓶-20 ℃存放48 h，30 ℃水浴中解凍。

1.2.3.1 脫脂乳對植物乳桿菌凍干菌劑細胞存活率的影響 將脫脂乳配成2%、4%、6%、8%、10%和12%的濃度作為保護劑，以不加脫脂乳的蒸餾水為空白對照，凍干后保藏解凍，測定植物乳桿菌G1-28活菌數N1，計算存活率。

1.2.3.2 海藻糖對植物乳桿菌凍干菌劑活菌數的影響 將海藻糖配成1%、2%、3%、4%和5%的濃度作為保護劑，以不加海藻糖的蒸餾水為空白對照，凍干后保藏解凍，測定植物乳桿菌G1-28活菌數N1，計算存活率。

1.2.3.3 山梨醇對植物乳桿菌凍干菌劑活菌數的影響 將山梨醇配成1%、2%、3%、4%和5%的濃度，以不加山梨醇的蒸餾水為空白對照，凍干后保藏解凍，測定植物乳桿菌G1-28活菌數N1，計算存活率。

1.2.3.4 甘油對植物乳桿菌凍干菌劑活菌數的影響

將甘油配成1%、2%、3%、4%和5%的濃度，以不加甘油的蒸餾水為空白對照，凍干后保藏解凍，測定活菌數N1，計算存活率。

1.2.4 凍干保護劑的正交試驗 根據單因素實驗結果，以細胞存活率為指標設計四因素三水平的正交實驗，正交實驗的因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Level of orthogonal experimental factors

1.2.5 植物乳桿菌凍干發酵劑保存性測定 將真空冷凍干燥后的植物乳桿菌G1-28發酵劑裝入經滅菌處理的鋁箔聚酯復合袋內，分別采用真空和常壓包裝，在-20、-4 ℃和室溫下分別保藏2個月和4個月，進行平板菌落計數[14]。

1.3 數據處理

所有實驗重復三次，每次兩個平行樣。采用SAS8.1軟件進行實驗分析。

2 結果與分析

2.1 離心條件的確定

離心是發酵劑制備的關鍵工藝環節，因此實驗研究了離心轉數及時間對收獲的活細胞濃度的影響見表2。

表2 離心條件對活細胞濃度的影響Table 2 Effects of centrifugal conditions on the concentration of living cells

由表2可以看出，當離心轉速為3000和4000 r/min時，由于離心轉速較低，有些小細胞不易被收集，但當離心轉速達到6000 r/min時，過高的離心轉速容易導致細胞的死亡，使平板計數法測定的活細胞數較低，因此，較適宜的離心收集條件為5000 r/min，20 min，此時，收獲的活細胞數是離心前的96.26%。

2.2 植物乳桿菌凍干保護劑的確定

2.2.1 植物乳桿菌凍干保護劑的單因素實驗 微生物細胞在冷凍的過程中，細胞內大量水分結冰后會形成較大的冰晶，從而對微生物的細胞膜造成較大的損傷，導致冷凍后菌體細胞的死亡率很高。采用海藻糖、脫脂乳、山梨醇以及甘油等作為單一冷凍保護劑可降低細胞的死亡率[15]，因此實驗研究了脫脂乳、海藻糖、山梨醇及甘油單獨使用對凍干后乳酸菌存活率的影響。

2.2.1.1 脫脂乳對植物乳桿菌凍干菌劑細胞存活率的影響 脫脂乳的成分主要是蛋白質和乳糖，將其溶解在水中是一種膠體溶液，脫脂乳中的蛋白質顆粒的直徑較小，在1～2 nm之間，將乳酸菌添加到脫脂乳溶液中，乳酸菌菌體細胞處于蛋白質分子的包圍之中，在冷凍過程中可阻止細胞內形成大得冰晶，能對乳酸菌菌體細胞起到很好的保護作用，有助于保持乳酸菌菌體的活性[16]。Khem等[17]的研究也表明脫脂乳也能在干燥過程中降低升溫的速度，減少細胞的壓力，從而起到對細胞的保護作用。由圖1可以看出，當脫脂乳濃度小于6%時，隨著脫脂乳濃度的增加，細胞存活率明顯增大，當脫脂乳濃度大于6%時，隨著脫脂乳濃度的增加，細胞存活率略有下降但基本平穩。脫脂乳濃度過高，容易使細胞脫水，影響了細胞的形態，從而影響了菌體的存活率，因此通過單因素確定的脫脂乳適宜濃度為6%。

圖1 脫脂乳濃度對細胞存活率的影響Fig.1 Effect of skim milk concentration on cell survival ratio

2.2.1.2 海藻糖對植物乳桿菌凍干菌劑活菌數的影響 在植物乳桿菌細胞冷凍的過程中，細胞中的蛋白質會發生脫水變性，海藻糖作為一種雙糖，在蛋白質冷凍的過程中能填充到因蛋白質失水而形成的空缺中，從而有效的抑制微生物中的蛋白質在冷凍過程中發生的變性[18]。由圖2可以看出，海藻糖添加量在0～2%范圍內，隨著海藻糖濃度的增加，植物乳桿菌細胞存活率逐漸提高；但當海藻糖濃度大于2%時，隨著海藻糖濃度的增加，植物乳桿菌細胞存活率的呈現平穩趨勢。Ambros等[19]研究也表明了在真空干燥狀態下，海藻糖具有保護益生菌穩定性的作用。通過單因素實驗確定海藻糖適宜濃度為2%。

圖2 海藻糖濃度對細胞存活率的影響Fig.2 Effect of trehalose concentration on cell survival ratio

2.2.1.3 山梨醇對植物乳桿菌凍干菌劑活菌數的影響 由圖3可以看出，山梨醇濃度在0～2%的范圍內，隨著山梨醇濃度的增加，植物乳桿菌細胞存活率逐漸提高，當山梨醇濃度為2%時，植物乳桿菌凍干后的存活率最高為60.50%。實驗表明2%的山梨醇對植物乳桿菌起到了較好的保護作用。山梨醇具有良好的保濕性能，在溶液中會與水分子發生結合，容易滲透到微生物細胞內，在冷凍條件下可增加溶液的粘性，從而抑制水的結晶，能保護細胞的活性，和甘油一起使用具有增效作用[18]。因此，通過單因素實驗確定山梨醇適宜濃度為2%。

2.2.1.4 甘油對植物乳桿菌凍干菌劑活菌數的影響

由圖4可以看出，甘油濃度為0～3%時，隨著甘油濃度的增加，植物乳桿菌細胞存活率逐漸提高，但當甘油濃度為3%時，植物乳桿菌細胞存活率最高，達到65.20%。甘油作為一種小分子物質，能以自由擴散的方式透過微生物的細胞膜。甘油易溶于水，并易與水分子發生結合作用。在添加了甘油的菌懸液中，微生物在凍干的過程中能通過水合作用增加溶液的粘性，減弱水的結晶過程，對活細胞有保護作用[20]。因此，通過單因素實驗確定甘油適宜濃度為3%。

圖3 山梨醇濃度對細胞存活率的影響Fig.3 Effect of sorbitol concentration on cell survival ratio

圖4 甘油濃度對細胞存活率的影響Fig.4 Effect of glycerol concentration on cell survival ratio

2.2.2 凍干保護劑的正交試驗

2.2.2.1 正交試驗設計及結果 由單因素實驗可以看出，脫脂乳、海藻糖、山梨醇和甘油作為凍干保護劑能明顯提高植物乳桿菌凍干菌種細胞的的存活率，但保護劑單獨使用時，植物乳桿菌凍干后細胞最大的存活率只能達到65.20%，為了進一步提高植物乳桿菌凍干菌種的存活率，實驗以單因素實驗確定的脫脂乳6%，海藻糖2%，山梨醇2%，甘油3%為中心點，采用四因素三水平的正交實驗，研究脫脂乳、海藻糖、山梨醇和甘油四種保護劑聯合使用時，保護劑的最佳配比，正交實驗結果見表3。

由表3可以看出，各因素對植物乳桿菌G1-28凍干菌體存活率影響的主次順序依次是甘油＞海藻糖＞山梨醇＞脫脂乳。最佳培養基配方為A3B2C3D3，此配方不在正交試驗的9組配方中，因此需要進行驗證實驗。

2.2.2.2 驗證實驗 根據正交試驗所獲得的最優凍干保護劑配方進行植物乳桿菌的凍干實驗，即以脫脂乳7%，海藻糖2%，山梨醇3%，甘油4%為保護劑的條件下進行菌懸液的凍干實驗，平均細胞存活率為93.20%±0.4%。正交試驗結果證明了保護劑聯合使用可提高菌體的存活率，這主要是由于不同的保護劑能通過不同的機理和方式對菌體起到保護作用。與本文研究結果相似，文獻[16,21,22-23]也證明了復合保護劑的保護效果顯著高于單一保護劑。Chen等[24]采用響應面優化方法優化了Bifidobacterium bifidumBB01凍干過程中的保護劑配方，在甘氨酸為5.5%，碳酸氫鈉為0.8%，低聚木糖為7%，精氨酸為4.5%，脫脂牛奶為25%的復合保護劑中，細胞可存活率可提高至90.37%。Lee等[25]研究表明Lactobacillus plantarumJH287在真空冷凍過程中的最佳最佳保護介質為10%山梨醇和10%脫脂牛奶，在此條件下存活率可達86.37%。Chen等[24]和Lee等[25]確定的復合保護劑獲得的細胞存活率略低于本實驗的結果，與本文結果相同的是復合保護劑配方中脫脂牛乳都是主要的組分。這些研究結果表明乳酸菌凍干過程中復合保護劑可達到理想的保護效果，凍干后細胞的存活率可提高到85%以上。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experimental

2.2.3 凍干發酵劑保存性能測定 將真空冷凍干燥后的植物乳桿菌G1-28發酵劑，裝入經滅菌處理的鋁箔聚酯復合袋內，分別采用真空和常壓包裝，在-20、-4 ℃和室溫下分別保藏2個月和4個月，進行平板菌落計數，測定植物乳桿菌細胞存活率，實驗結果見表4。

由表4可以看出，在相同的保藏溫度下，在真空保藏后，發酵劑中的植物乳桿菌細胞的存活率高于常壓保藏，在真空保藏條件下，-20 ℃的低溫保藏后發酵劑中植物乳桿菌細胞的存活率高于室溫和-4 ℃條件下保藏。因此確定制備的凍干發酵劑在的適宜保藏條件為真空條件下-20 ℃保藏。王桃等[11]的研究也表明了較低的保藏溫度更有力于凍干菌體活力的保持。

3 結論

論文以具有體外降膽固醇降甘油三酯功能植物乳桿菌G1-28為菌種，對其凍干發酵劑的制備過程中的離心、保護劑配方及保藏效果進行了系統的研究。實驗結果表明植物乳桿菌G1-28菌懸液的離心收集條件為5000 r/min，20 min，在此條件下活細胞收集率為96.26%。植物乳桿菌G1-28最佳凍干保護劑為脫脂乳7%，海藻糖2%，山梨醇3%，甘油4%，在此條件下細胞存活率最大為93.20%。凍干菌粉保藏條件為在抽真空條件下-20 ℃保藏，保藏4個月，細胞存活率為97.1%。研究結果表明，復合保護劑可以通過多種保護機制來減少冷凍干燥對菌體細胞的損傷，其冷凍干燥后細胞的存活率明顯高于單一保護劑。制備的植物乳桿菌G1-28菌粉可作為泡菜、蘋果發酵飲料等的發酵劑，也可以作為益生菌菌粉直接食用，產品具有使用、運輸、貯藏方便，不易污染雜菌等優點。下一步將進行擴大規模實驗，為菌劑的生產及應用提供更直接的基礎數據。

表4 發酵劑保存性測定Table 4 Determination of retention of starter