海洋來源產低溫幾丁質酶菌株的誘變選育及酶學性質研究

陳立功，吳家葳，張金平，張慶芳，遲乃玉，王曉輝，王夢雨

（大連大學生命科學與技術學院，遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，大連市合成生物學重點實驗室，遼寧大連 116600）

幾丁質（chitin）是地球上含量僅次于纖維素的可再生資源，在海洋當中含量十分豐富[1-3]。它廣泛存在于動植物及微生物中，在蝦蟹殼中的含量極高，隨著海洋中蝦蟹的死亡逐步累積，主要靠海洋中微生物分泌的幾丁質酶完成降解[4-7]。但由于自然狀態下，幾丁質多以晶體狀態存在，性質穩定，不溶于水，自然狀態下不易降解，所以降解速度遠遠趕不上產生的速度[8-9]。幾丁質酶（chitinase，EC 3.2.1.14）廣泛存在于自然界的各種生物體中，能夠降解幾丁質生成幾丁寡糖、幾丁單糖及其衍生物，這些降解產物由于具有良好的組織兼容性及免疫抗菌作用被廣泛應用于醫藥、農業等領域[10-12]。

從自然環境中篩選到的野生菌往往產酶活性不高，人們往往通過誘變育種的方式來選育產酶活性高的菌株。根據方式不同分為物理誘變和化學誘變，物理誘變中比較常用的為輻射誘變，即用β射線等射線、粒子或紫外照射誘發菌株變異[13-15]。化學誘變是利用化學誘變劑對菌株進行處理，使其發生基因突變，常用的化學誘變劑有硫酸二乙酯、乙烯亞胺、亞硝酸鈉等[16]。為達到更好的誘變效果，往往選擇兩種或多種方法進行誘變，稱之為復合誘變。

本研究對產低溫幾丁質酶菌株Photobacteriumsp.LG-1進行了BIOLOG生理生化實驗，確定了菌株對碳源的利用嗜好性和對化學物質的敏感程度，為提高其產酶活性，對菌株進行了誘變選育，并對菌株LG-1酶學性質及抑菌特性進行了初步研究，為低溫幾丁質酶在工、農業等領域的應用提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產低溫幾丁質酶菌株 實驗室前期從中國遼寧大連渤海海域5～100 m（123°391′E，39°6972′N）篩選得到，命名為Photobacteriumsp.LG-1[17]；篩選培養基 膠體幾丁質1.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，K2HPO45.0 g/L，KH2PO45.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，MgSO4·7H2O 5.0 g/L, ZnSO4·7H2O 5.0 g/L，FeSO4·7H2O 5.0 g/L，瓊脂1.5%～2.0%，海水，pH 7.0；2216E種子培養基牛肉膏5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，原地海水配制，pH自然；粉狀幾丁質培養基 粉狀幾丁質5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，原地海水配制，pH自然；幾丁質粉（chitin）、N-乙酰氨基葡萄糖 美國Sigma公司；胰蛋白胨（Tryptone） 生工生物工程（上海）股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 北京索萊寶科技有限公司；其它試劑 均為國產分析純試劑。

LTI-700低溫恒溫培養箱 上海愛朗儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；CRY-2112恒溫搖床 上海茸研儀器有限公司；Thermo Multiskan1510酶標儀 芬蘭Labsystems公司；GEN III Microstation全自動微生物鑒定儀 美國BIOLOG公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LG-1的BIOLOG生理生化實驗 將LG-1劃線到BUG培養基上培養24 h后，用無菌棉簽蘸取單菌落至培養液B中，透光度98%，接入GenⅢ微孔板于33 ℃培養37 h，使用BIOLOG MicroStation儀器進行讀數，根據最終獲得的表型指紋同BIOLOG數據庫中的數據進行比較，以判斷菌株對碳源的利用嗜好性和對化學物質的敏感程度。

1.2.2 酶活測定 取發酵液10000 r/min離心5 min，取0.5 mL上清，與0.5 mL 1%膠體幾丁質混合，25 ℃下保溫15 min，10000 r/min離心5 min，取上清200 μL煮沸5 min，冷卻后，加入200 μL DNS溶液煮沸5 min，冷卻后加入600 μL超純水，10000 r/min離心10 min，取200 μL于96空板中測定OD520，設3個重復，取平均值，酶活單位定義（U）：在上述條件下，催化產生l μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量[17]。

1.2.3 膠體幾丁質的制備 根據王曉輝等[18]的方法進行1%膠體幾丁質的制備：取10 g幾丁質置于研缽，緩慢加入100 mL濃鹽酸并不斷攪拌1 h，保鮮膜封口后于冰箱4 ℃下過夜。大量超純水反復洗至中性，離心后用0.1 moL/L磷酸緩沖液定容為1 L。

1.2.4 酶活曲線測定 挑取LG-1單菌落接種于5 mL種子培養基，20 ℃、160 r/min培養24 h。種子液以1%的接種量轉接于100 mL粉狀幾丁質培養基，20 ℃、160 r/min培養，每隔24 h取樣測定酶活性。三組平行實驗。

1.2.5 菌株誘變育種

1.2.5.1 菌懸液制備 挑取單菌落接種于5 mL種子培養基，20 ℃、160 r/min培養24 h。種子液以1%的接種量轉接于100 mL 2216E培養基，20 ℃、160 r/min培養，由實驗室前期試驗[17]可知菌株LG-1在該培養條件下，12～52 h為對數生長期，此階段菌株生長情況良好，取36 h菌液4000 r/min離心10 min，沉淀用無菌海水稀釋至菌體濃度為105cell/mL，作為菌株誘變育種的初始菌懸液。

1.2.5.2 紫外誘變 實驗前將紫外燈功率調至20 W并打開預熱20 min，吸取10 mL菌懸液至無菌培養皿中，并將培養皿置于100 r/min磁力攪拌器上使用無菌轉子緩慢攪拌。將紫外燈置于無菌培養皿上方30 cm處照射，每隔1 min取100 μL菌懸液均勻涂布至篩選培養基上，20 ℃培養3 d[19-20]。以未照射的菌懸液作為對照組，統計誘變前后的菌落數量，計算致死率，選擇致死率80%～90%的平板挑取透明圈較大的菌株接種于5 mL種子培養基，20 ℃、160 r/min培養24 h。種子液以1%的接種量轉接于100 mL粉狀幾丁質培養基，20 ℃、160 r/min培養96 h，測酶活并計算酶活提高率。致死率及酶活提高率計算公式如下：

1.2.5.3 化學誘變 在3.5 mL菌懸液中加入1 mL的硫酸二乙酯和0.5mL的無水乙醇，混合均勻后每隔5 min加入0.5 mL 25%硫代硫酸鈉溶液終止反應，對照組加入等量無菌水處理。取100 μL菌懸液均勻涂布至篩選培養基上，20 ℃培養3 d，統計菌落數量[20]，按照式（1）計算致死率，選擇致死率80%～90%的平板，挑取透明圈較大的菌株接種于5 mL種子培養基，20 ℃、160 r/min培養24 h。種子液以1%的接種量轉接于100 mL粉狀幾丁質培養基，20 ℃、160 r/min培養96 h，測酶活并按照式（2）計算酶活提高率。

1.2.5.4 復合誘變 以方法1.2.5.2中紫外誘變所得產低溫幾丁質酶活最高的菌株作為出發菌株，按照方法1.2.5.1制備菌懸液，菌體濃度為105cell/mL；按照方法1.2.5.3進行化學誘變，計算致死率并選擇致死率80%～90%的平板，挑取透明圈較大的菌株發酵測酶活。

1.2.5.5 遺傳穩定性測定 分別選擇紫外誘變、化學誘變和復合誘變后酶活最高的菌株進行連續傳代培養，測其酶活，確定誘變菌株的遺傳穩定性。

1.2.6 低溫幾丁質酶的酶學性質研究 菌株LG-1在粉狀幾丁質培養基中20 ℃、160 r/min培養96 h，10000 r/min離心5min，取上清液進行酶學性質研究。

1.2.6.1 最適溫度和溫度穩定性 為研究溫度對幾丁質酶活的影響，在0～65 °C溫度下反應后測酶活。以酶活最大值為100%，根據酶在不同溫度下相對活性繪制曲線，確定酶的最適反應溫度。同時，將粗酶液分別置于0～65 °C下保溫1 h，然后在最適反應pH和最適反應溫度下檢測殘余酶活，與未經過處理的酶液進行比較，繪制相對活性曲線。

1.2.6.2 最適pH和pH穩定性 在最適反應溫度，pH3～12的50 mmol/L緩沖液（pH3.0～5.0 phosphatecitrate、pH6.0～10.0 Tris-HCl、pH11.0～12.0 Na2HPO4-NaOH）中測定酶活，以酶活最大值為100%，根據酶在不同pH下的相對活性繪制曲線，確定酶的最適反應pH。同時，將粗酶液分別置于50 mmol/L不同pH緩沖液（pH3.0～5.0 phosphate-citrate、pH6.0～10.0 Tris-HCl、pH11.0～12.0 Na2HPO4-NaOH）中，20 °C下保溫1 h，然后在最適反應pH和最適反應溫度下檢測殘余酶活，與未經過處理的酶液進行比較，繪制相對活性曲線。

1.2.6.3 不同濃度金屬離子及化學試劑對酶活的影響 在酶活測定反應體系中分別加入終濃度為1 或5 mmol/L的Ni2+、Mn2+、Ag+、Fe3+、Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Na+、Zn2+等金屬離子或β-mercaptoethanol（β-巰基乙醇）、尿素（Urea）、EDTA、Triton-100、Tween-80、2,3-butanedione（2,3-丁二酮）、保險粉、SDS、DTT等化學試劑。對照組加入相應體積的無菌水，測定酶活，計算相對活性。

1.2.7 抑菌性試驗 參照Han等[21]和Mehmoo等[22]的方法，通過研究抑制孢子萌發實驗測定LG-1抑菌活性。具體方法如下：將長有毛霉、青霉、根霉、黑曲霉、玉米腐爛病、稻瘟病、棉花枯萎病的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基挑碎，用鑷子（滅菌）夾一塊至盛有1 mL無菌水的離心管中，劇烈震蕩2 min，制成孢子懸液。吸取100 μL孢子懸液涂布在固體發酵培養基上，然后用滅菌的玻璃棒蘸取LG-1菌體分別點接在培養基中央，20 ℃恒溫倒置培養5～7 d，觀察生長情況。

1.3 數據處理

所有實驗均為三組平行。使用GraphPad Prism 8.0.1軟件對誘變育種數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 菌株LG-1的BIOLOG生理生化實驗

傳統菌株的生理生化實驗方法主要是依靠人操作進行的，該方法存在操作復雜、耗時長等問題。BIOLOG全自動微生物鑒定儀可檢測菌株對碳源的利用嗜好性和對化學物質的敏感程度，操作簡單且迅速高效。化學物質敏感性試驗結果表明該菌適合在高鹽環境中生長，可能是因為菌株來源于海洋；微弱耐受醋竹桃霉素和萬古霉素，對低pH、D-絲氨酸、二甲胺四環素、林肯霉素、萘啶酮酸、氨曲南、及丁酸鈉不耐受。GenⅢ微孔板對該菌進行碳源的利用程度試驗陽性結果如下表1。可見該菌對糊精、D-麥芽糖、D-海藻糖、蔗糖、β-甲酰-D-葡糖苷、N-乙酰-D-葡糖胺、D-果糖、肌苷、D-甘露糖、甘油、明膠、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-絲氨酸、D-葡糖酸、檸檬酸、L-蘋果酸、吐溫40、β-羥基-D,L丁酸、丙酸和乙酸利用良好，對α-D-葡萄糖、D-山梨醇、D-阿拉伯醇、果膠、葡糖醛酰胺、丙酮酸甲酯、溴-丁二酸、α-酮-丁酸及乙酰乙酸利用較佳，對其余的碳源利用不佳。由此可知該菌株可廣泛利用部分單糖、羧酸和脂肪酸，以及大部分氨基酸碳源。

2.2 菌株LG-1酶活曲線

自然界中幾丁質含量十分豐富，大多以晶體結構存在，相比于膠體幾丁質，粉狀晶體幾丁質因其結構特性更不易被降解[23-25]。如圖1所示，在該培養條件下，菌株LG-1在24～96 h內酶活急劇升高，96 h時酶活達到最大值為1.134 U/mL，比實驗室前期用膠體幾丁質培養基測的最大酶活0.932 U/mL高20%以上[17]。96 h后，隨著培養時間增加，酶活逐步下降，但在240 h時，酶活仍為最大酶活的50%以上，360 h時，酶活仍為最大酶活的25%以上，說明菌株LG-1在該培養條件下可較長時間持續作用。確定菌株LG-1在該條件下的最適培養時間為96 h。

圖1 產幾丁質酶菌株LG-1酶活曲線Fig.1 Chitinase-producing LG-1 enzyme production

2.3 菌株誘變育種

2.3.1 紫外誘變 對菌株LG-1進行紫外誘變，致死率結果如圖2所示。隨著紫外燈照射時間的延長，菌株致死率不斷增加，照射14 min時，菌株致死率已高于60%，照射20 min后菌株致死率超過80%，照射22 min時致死率為85.19%。通常情況下致死率在80%～90%時正突變率較高[20]，因此選擇紫外照射22 min時平板上7株透明圈較大的單菌落進行發酵培養，測定幾丁質酶活性。

由表2可知，7株紫外誘變后的菌株中，有4株菌酶活明顯提高，其中菌株LG-1-U-4酶活最高，為1.899 U/mL，與原始菌株LG-1相比，酶活提高率高達69.22%；誘變后有兩株菌酶活降低，其中菌株LG-1-U-6酶活降低最多，比原始菌株降低了30.57%。

圖2 菌株LG-1紫外誘變致死率Fig.2 Lethality rate of LG-1 induced by ultraviolet radiation

表2 紫外誘變菌株產幾丁質酶活性Table 2 Chitinase activity of strain after UV mutagenesis

2.3.2 化學誘變 菌株LG-1經化學誘變后，致死率如圖3所示。隨著化學試劑對菌株作用時間的延長，菌株致死率不斷增加，作用超過15 min后，菌株致死率急劇升高。誘變30 min后菌株致死率超過80%，誘變35 min時，致死率為86%。因此選擇誘變35 min時平板上6株透明圈較大的單菌落進行發酵培養，測定幾丁質酶活性。

圖3 菌株LG-1化學誘變致死率Fig.3 Lethality rate of LG-1 induced by chemical mutagenesis

由表3可知，6株化學誘變后的菌株中，有5株菌酶活得到提高，與原始菌株LG-1相比，其中有4株菌酶活提高率超過20%。菌株LG-1-H-1酶活最高，為1.848 U/mL，酶活提高率高達64.74%；與紫外誘變相比，酶活提高率略有降低。

2.3.3 復合誘變 菌株LG-1-U-4比菌株LG-1-H-1酶活更高，因此對菌株LG-1-U-4進行化學誘變，完成菌株LG-1的復合誘變過程。按照式（1）計算致死率，結果如圖4所示。與菌株LG-1化學誘變致死率曲線相比，菌株LG-1-U-4在進行化學誘變時致死率更高、更快，誘變25 min時，致死率為84.34%，當誘變時間超過35min后，菌株致死率為100%。所以菌株LG-1-U-4進行化學誘變時，不能選擇菌株LG-1化學誘變最佳時間35 min，而應該為25 min。挑取透明圈較大的7株菌進行發酵培養，測酶活并按照式（2）計算酶活提高率。

表3 化學誘變菌株產GOD酶活Table 3 GOD activity of strain after chemical mutagenesis

圖4 菌株LG-1-U-4復合誘變致死率Fig.4 Lethality rate of LG-1-U-4 induced by composite mutagenesis

由表4可知，菌株LG-1-U-4經化學誘變后，7株菌中有4株菌酶活降低，有3株菌酶活升高，其中菌株LG-1-F-4酶活最高，達2.690 U/mL。與菌株LG-1-U-4相比，菌株LG-1-F-4酶活提高率為41.65%，與原始菌株LG-1相比，酶活提高率高達139.78%。

表4 復合誘變菌株產GOD酶活Table 4 GOD activity of strain after composite mutagenesis

2.3.4 誘變菌株產酶遺傳穩定性實驗 為獲得產酶穩定的誘變菌株，對其進行連續10次傳代培養，確定其產酶遺傳穩定性，結果如圖5所示。紫外誘變菌株LG-1-U-4遺傳穩定性較差，在連續傳代4次后，酶活逐漸降低。化學誘變菌株LG-1-H-1和復合誘變菌株LG-1-F-4遺傳穩定性良好，在10次連續傳代過程中，酶活雖稍有波動，但均分別維持在1.848 和2.690 U/mL左右。

圖5 菌株遺傳穩定性Fig.5 Genetic stability of strains

2.4 低溫幾丁質酶的酶學性質分析

2.4.1 最適溫度和溫度穩定性

2.4.1.1 最適反應溫度分析 由圖6最適溫度曲線可知，該酶在25～40 °C溫度內有較高酶活，達到80%以上，最適反應溫度為35°C；溫度低于或高于35℃，酶活都降低，但相對于升高溫度來說，降低溫度時，酶活降低的速度更慢。10°C時，酶活為最適溫度下酶活的30%以上，且在0°C時仍有酶活。在40～65°C溫度內，隨著溫度的升高酶活力快速降低，50 °C時酶活力不足最適溫度下酶活的40%。

圖6 幾丁質酶的最適溫度和溫度穩定性Fig.6 Optimum temperature and thermal stability of the chitinase

2.4.1.2 熱穩定性分析 由圖6熱穩定性曲線可知，該酶在低于30 °C的環境下具有較好的熱穩定性，保溫1 h處理后，酶活保留80%以上；在30 °C的環境下溫育1 h后，酶活仍保留65%以上。當溫度高于40 °C時，酶的熱穩定性急劇下降，50 °C溫育后，酶活僅剩余20%左右。

2.4.2 最適pH和pH穩定性

2.4.2.1 最適反應pH分析 由圖7最適pH曲線可知，該幾丁質酶在pH 7.0～8.0環境下酶活性較高，達到85%以上，pH為8.0時，酶活性最高；當pH小于7.0或大于8.0時，酶活急劇下降，但pH為9.0時，酶活仍為最大值的75%以上；pH為6.0時，酶活驟降至40%左右，pH為3.0～5.0時酶活低于40%；所以該幾丁質酶在弱堿性環境中能更好的發揮作用。

圖7 幾丁質酶的最適pH和pH穩定性Fig.7 Optimum pH and pH stability of the chitinase

2.4.2.2 pH穩定性分析 由圖7 pH穩定性曲線可知，該幾丁質酶在pH 7.0～9.0間較為穩定，剩余酶活力在80%以上，當pH為10.0時，相對酶活力剩余60%以上，pH為6.0時，相對酶活力剩余50%左右。當pH小于5.0或大于11.0時，殘余酶活均小于35%，所以該酶適合保存在偏弱堿性的環境中。

2.4.3 不同濃度金屬離子及化學試劑對酶活的影響

如表5所示，Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Na+均對幾丁質酶活性有促進作用，Ca2+、K+、Mg2+和Na+在海洋中含量豐富，研究表明其對海洋低溫酶活性有顯著促進作用[18-19]。且Ca2+、K+、Na+濃度越高促進作用越明顯，濃度為5 mmol/L的Ca2+提高了將近60%的酶活性。而 5mmol/L的Mg2+和Cu2+對酶活的促進作用沒有濃度為1 mmol/L效果好，但濃度1 mmol/L的Cu2+提高了85%的酶活性。Ni2+、Mn2+、Ag+、Fe3+、Zn2+均對幾丁質酶活性有不同程度的抑制作用，其中5 mmol/L的Fe3+和Zn2+抑制效果最明顯。由表5中不同濃度化學試劑對酶活的影響實驗結果可 知，不 同 濃 度 的β-mercaptoethanol、EDTA、Triton-100、Tween-80、2,3-butanedione、SDS和DTT對幾丁質酶活性均有抑制作用，其中5 mmol/L的SDS幾乎使酶失活。高濃度的保險粉對酶活性抑制效果明顯，Urea對酶活性幾乎沒有影響。

2.5 LG-1抑菌性的定性研究

由圖8可知，菌株LG-1在涂有霉菌的培養基上生長7 d后，在根霉、黑曲霉、毛霉和玉米腐爛病的平板上產生明顯的抑菌圈，說明菌株LG-1對根霉、黑曲霉、毛霉和玉米腐爛病的生長有抑制效果。

3 結論與討論

目前，幾丁質酶研究報道中多為中高溫幾丁質酶，最適反應溫度在40～50 ℃，在高溫下易失活，低溫下活性很低或無酶活[26-27]。本研究對實驗室前期篩選到的產低溫幾丁質酶菌株Photobacteriumsp.LG-1進行了BIOLOG生理生化實驗，確定該菌株可廣泛利用部分單糖、羧酸和脂肪酸，以及大部分氨基酸等碳源。化學物質敏感性試驗結果表明該菌適合在高鹽環境中生長，對低pH不耐受。

表5 金屬離子及化學試劑對酶活的影響Table 5 Effects of metal ions and reagent on enzyme activity

圖8 菌株LG-1抑菌能力測定Fig.8 Antifungal activity of LG-1

為提高菌株LG-1產酶活性，對其進行了誘變育種，其中復合誘變效果最好，誘變后菌株LG-1-F-4酶活達2.690 U/mL，酶活提高率為139.78%，且菌株產酶遺傳穩定性良好。紫外誘變比化學誘變酶活提高率略高，但菌株產酶遺傳穩定性差，在傳代培養過程中，酶活降低。酶學性質研究結果表明，該幾丁質酶最適反應溫度為35 ℃，0 ℃仍具有催化活性，符合低溫酶特性；最適反應pH為8.0，在偏堿性環境中有較好的穩定性。金屬離子Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Na+均對幾丁質酶活性有促進作用。抑菌性試驗證明該菌對根霉、曲霉、毛霉和玉米腐爛病等有抑制活性。本研究可以為今后幾丁質酶在農業生產上實現生物防治及工業應用等提供參考。