響應面法優化西蘭花種子中異硫氰酸酯的酶解制備工藝

楊 杜，弓小星，王雅杰，郝曉慶，梁軒銘，鞏 強，蘇 銳,

（1.中北大學化學工程與技術學院，山西太原 030051；2.山西省食品質量安全監督檢驗研究院，山西太原 030012）

癌癥是威脅人類生命最嚴重的惡性疾病之一，治療難度大，治療癌癥最有效的舉措是控制其發生[1]。植物及其天然產物具有防癌抗癌的潛能，多項流行病學研究發現，多食用十字花科蔬菜，如西蘭花、甘藍、萵苣和白蘿卜等，可以降低患癌的風險[2]。主要原因是十字花科植物中富含重要的次生代謝產物硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷），硫苷在內源性黑芥子酶的催化下，先水解成D-葡萄糖和一種不穩定的糖苷中間產物，進一步轉化為活性物質包括異硫氰酸酯（Isothiocyanates，ITCs）、硫氰酸鹽、腈、亞硫腈或噁唑烷-2-硫酮等[3-5]，如圖1所示。其中ITCs是一類具有R-N=C=S結構通式的化合物，是II相解毒酶的天然誘導劑，可使致癌物質分解，起到抑制癌細胞增殖的作用，是天然的抗腫瘤活性物質[6-8]。除此以外，ITCs還具有抑菌、抗炎、抗氧化等多種生物學活性，可作為天然抑菌劑、食品添加劑、殺蟲劑以及抗腫瘤藥物等[9-10]，具有廣泛的應用價值。

目前，制備ITCs的方法主要有化學合成法和酶法，其中化學合成法步驟繁瑣，合成率低，且對環境不友好[11]。酶法制備是利用十字花科植物中硫代葡萄糖苷-黑芥子酶這一系統[12-13]，從植物體中提取ITCs，具有操作簡單，環保安全，產率相對較高的特點。但酶解產物的形成取決于硫苷的結構以及酶解反應條件，主要包括酶解時間、溫度、壓力、pH和Fe2+的存在。Latte等[14]研究發現，當反應溶液pH為中性時，有利于前體GLS水解生成異硫氰酸鹽，但在環硫特性蛋白（Epithiospecifierprotein，ESP）、Fe2+存在或在酸性條件下，酶解產物會形成大量的腈類等[15]。Yuan等[16]和Wu等[17]利用十字花科植物內源黑芥子酶，采用邊水解邊萃取的方法，考察了酶解時間、萃取時間以及金屬離子對ITCs提取的影響。采用內源酶酶解制備ITCs工藝簡單，但植物中內源黑芥子酶不能完全釋放，導致酶解時間長，效率低。Guo等[18]預先制備黑芥子酶，采用添加外源酶水解的方式制備ITCs，酶活性高、酶解時間短，且ITCs的產率相對較高。同時，采用響應面的方法對pH、抗壞血酸和EDTA因素進行分析，結果表明，這三種因素對異硫氰酸鹽的提取率有顯著影響。只有在酶解條件適宜時，酶促反應動力學才會朝著有利于生成ITCs的方向進行。因此，優化硫苷的酶解浸提條件，是成功制備ITCs的關鍵環節。

ITCs的分析測定方法主要有：分光光度法和色譜法，其中色譜技術又包括高效液相色譜法[19]、氣相色譜法和氣質聯用、液質聯用。氣相色譜-質譜聯用[20]法結合了氣相色譜和質譜的優點，具有靈敏度高、分析速度快等特點，可同時完成待測組分的分離和鑒定。

本研究以西蘭花種子為原料，采用外源酶解的方法，制備ITCs。在單因素實驗基礎上，以酶解時間、酶解溫度、酶解pH為自變量，以ITCs得率為響應值，利用Design-export10軟件設計響應面實驗，同時采用硫脲法和GC-MS作為ITCs的定量定性檢測方法，優化ITCs的酶解提取工藝，為ITCs制備和綜合利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷酸二氫鈉 天津市科密歐化學試劑有限公司；碳酸氫鈉 天津市北辰方正化學試劑廠；乙二胺四乙酸 天津市光復科技發展有限公司；抗壞血酸、二硫蘇糖醇 阿達瑪斯試劑有限公司；石油醚、二氯甲烷 上海泰坦科技股份有限公司；以上試劑 均為分析純。

BGZ-240電熱鼓風干燥箱 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；BJ-400粉碎機 上海拜杰實業有限公司；MYP11-2磁力攪拌器 常州方科儀器有限公司；TDL-5000dR冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑芥子酶的制備 取烘干、粉碎后的西蘭花種子，過60目篩，石油醚脫脂三次，真空抽濾，得到西蘭花種子粉末，至錐形瓶中備用。另取新鮮的芥菜籽，加入液氮粉碎，過60目篩，并脫脂處理，加入0.2 moL/L的磷酸緩沖液，超聲振蕩20 min，4000 r/min下冰浴離心30 min，并經硫酸銨分級沉淀，透析得粗黑芥子酶液，冷凍干燥，得黑芥子酶粉末。參照Li等[21]的方法，以黑芥子硫苷酸鉀為底物，測得制備的粗酶液酶活為1.267 U/g。

圖1 硫苷酶解過程Fig.1 Hydrolysis of glucosinolates schematic

1.2.2 ITCs提取工藝 向西蘭花粉末中加入用磷酸鹽溶解的粗黑芥子酶，并加入0.2%的抗壞血酸，在一定溫度下，酶解一定的時間，酶解結束后，加入一定量的二氯甲烷浸提液，室溫浸提2 h，之后離心取下層浸提液，測ITCs提取率。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 酶量對ITCs提取率的影響 以脫脂西蘭花種子粉末為底物，稱取5等份，每份0.2 g，按照1.2.1的方法提取ITCs，在酶解時間為3 h，酶解溫度為30 ℃，浸提料液比為1:20 g/mL，pH為6.5的條件下，按酶與底物的質量比（1:5、1:4、1:3、1:2、1:1）混合，考察粗酶用量對ITCs提取率的影響。

1.2.3.2 酶解時間對ITCs提取率的影響 以脫脂西蘭花種子粉末為底物，稱取5等份，每份0.2 g，按照1.2.1的方法提取ITCs，在酶與底物的質量比為1:3，酶解溫度為30 ℃，pH為6.5，浸提料液比為1:20 g/mL的條件下，考察不同酶解時間（2、3、4、5、6 h）對ITCs提取率的影響。

1.2.3.3 酶解溫度對ITCs提取率的影響 以脫脂西蘭花種子粉末為底物，稱取5等份，每份0.2 g，按照1.2.1的方法提取ITCs，在酶與底物的質量比為1:3，酶解時間為3 h，pH為6.5，浸提料液比為1:20 g/mL的條件下，研究在不同酶解溫度（30、35、40、45、50 ℃）對ITCs提取率的影響。

1.2.3.4 酶解pH對ITCs提取率的影響 以脫脂西蘭花種子粉末為底物，稱取5等份，每份0.2 g，按照1.2.1的方法提取ITCs，當酶與底物的質量比為1:3，在酶解時間為3 h，酶解溫度為30 ℃，浸提料液比為1:20 g/mL的條件下，研究在不同pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）對ITCs提取率的影響。

1.2.3.5 浸提料液比對ITCs提取率的影響 以脫脂西蘭花種子粉末為底物，稱取5等份，每份0.2 g，按照1.2.1的方法提取ITCs，在酶與底物的質量比為1:3，酶解時間為3 h，酶解溫度為30 ℃，pH為6.5的提取條件下，研究了不同浸提料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）對ITCs提取率的影響。

1.2.4 響應面試驗 在單因素實驗基礎上，進行響應面實驗[22]，采用Box-Behnken模型[23-24]，選取酶解時間（A）、溫度（B）和pH（C）影響顯著的因素為自變量，以ITCs提取率為相應值（Y），設計三因素三水平響應面實驗，共17個處理組，各因素編碼值見表1。

1.2.5 硫脲法測ITCs提取率 參考NY1956-2008標準[25]，取0.2 g脫脂后的西蘭花粉末，加40 mg粗芥子酶和2.0 mL pH 7.0緩沖溶液，旋渦混合器充分混合，35 ℃下酶促反應2 h。加2.5 mL二氯甲烷，用旋渦混合器混合均勻，在室溫下振蕩0.5 h，4000 r/min下離心20 min。取6 mL 80%氨乙醇于具塞試管，用微量進樣器，取離心管下層有機相50 μL，加入到裝有80%氨乙醇的具塞試管中，蓋上塞。旋渦混合均勻，將具塞試管放入水浴鍋，50 ℃下加熱0.5 h，取出具塞試管，冷卻至室溫。用紫外分光光度計，10 mm石英比色皿測定光密度值，測定波長分別為235、245、255 nm，同時測定試樣空白溶液。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factor level design of response surface test

試樣中異硫氰酸酯的提取率（X）以每克干樣中異硫氰酸酯的毫克數（mg/g）表示，按以下公式計算：

式中：OD235、OD245、OD255分別代表試樣在245、235、255 nm處的光密度值。

1.2.6 GC-MS對酶解產物的分析 將含有ITCs的酶解提取產物，用有機濾膜過濾，注入GC進樣口進行分析。GC/MS使用7890A氣相色譜儀結合5975C Plus質譜儀分析。色譜條件如下[23]：氣相色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm，HP-5MS）采用氦氣為運載氣體，恒定流速為1.5 mL/min；進樣口溫度為300 ℃，進樣量為10 μL，分流比20:1。色譜柱升溫程序為：50 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；再以30 ℃/min升至300 ℃，保持15 min；質譜條件：EI離子源溫度：230 ℃；接口溫度：250 ℃；四極桿溫度：150 ℃；EI能量：70 eV；掃描范圍m/z：50～240。

定性定量方法：樣品采用GC-MS進行分析，通過MSDCHEM化學工作站對采集的數據進行處理，并根據各個化合物的分子離子峰、特征碎片離子以及色譜保留時間等與NIST11譜庫數據進行匹配，最終確定酶解產物的化學成分。并使用峰面積歸一化法計算硫代糖苷酶解產物中各組分的相對含量。

1.3 數據處理

實驗數據表示為三次重復（n=3）的平均值±標準差（SD），使用origin8對數據進行處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 酶量對ITCs提取率的影響 酶與底物的質量比對ITCs提取率的結果如圖2所示，當酶與底物的質量比為1:3時，ITCs的提取率達到最大。當底物量遠大于酶的用量時，酶解反應速度與酶的用量呈正比關系，此時由于酶的用量不足，西蘭花粉末中的糖苷底物不能完全得到水解，從而導致產物ITCs得率較低；增加酶的用量，底物能夠得到充分的釋放，但繼續增加酶的用量，底物與酶的反應已達到飽和，產物的量也不再增加，而且還會增加后續浸提溶液的體積，綜合考慮其最佳的酶與底物的質量比為1:3。

圖2 酶與底物的質量比對ITCs提取率的影響Fig.2 Effect of the mass ratio of enzyme and substrate on the extraction rate of ITCs

2.1.2 酶解時間對ITCs提取率的影響 酶解時間對ITCs提取率的結果如圖3所示，ITCs的提取率隨著酶解時間的延長顯著增加（P＜0.05），在酶解時間為4 h時達到最高。但酶解時間超過4 h之后，ITCs提取率有所下降。酶解時間較短時，底物硫代葡萄糖苷沒有得到充分酶解，產物ITCs得率較低；而在4 h之后，由于ITCs在水溶液中穩定性較差，發生加成反應而生成其他副產物。因此，隨著酶解時間的延長，反而會使產物得率有所下降。綜上，確定酶解最佳時間為4 h左右。

圖3 酶解時間對ITCs提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on extraction rate of ITCs

2.1.3 酶解溫度對ITCs提取率的影響 不同酶解溫度對ITCs提取率的影響如圖4所示。當酶解溫度低于40 ℃時，ITCs的提取率隨溫度的升高而逐漸增加。當酶解溫度升高到40 ℃時，酶解產物ITCs提取率最高。之后，隨著酶解溫度的進一步升高，酶解產物急劇減少。因此，40 ℃為黑芥子酶的最適酶解溫度。黑芥子酶是較為耐熱的酶，適當提高酶解溫度，有利于酶活力的提高；但酶解溫度過高時，也會使酶鈍化，降低酶的催化效率，同時還會影響酶解產物的穩定性。

圖4 酶解溫度對ITCs提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of ITCs

圖5 不同pH對ITCs提取率的影響Fig.5 Effect of different pH value on extraction rate of ITCs

2.1.4 不同pH對ITCs提取率的影響 不同pH對ITCs提取率的影響如圖5所示，pH是影響酶解效率的主要因素之一，不同的pH條件會影響酶解產物的類型。根據楊瑛潔等[5]研究，在中性條件下其前體硫代葡萄糖苷的酶解產物主要為ITCs，在有Fe2+或pH＜5.0存在下，降解產物則以腈類為主。本實驗結果也表明，酶解反應pH在4.5時，ITCs的提取率最低。而隨著反應pH的增加，ITCs的提取率表現為先增后降的趨勢，當pH為6.5時，ITCs的提取率最高，為最佳酶解反應pH。從本實驗結果可以看出，ITCs受pH的影響較大，酶解反應中溶液pH過酸或過堿都會影響酶的活力、催化效率以及酶解反應進程，因此，選擇pH5.5、6.5、7.5進行后續響應面試驗。

2.1.5 浸提料液比對ITCs提取率的影響 不同的提取料液比對ITCs提取率的影響，如圖6所示。當浸提料液比為1:20 g/mL時，ITCs的提取率最高，當浸提料液比為1:10～1:20 g/mL的范圍內時，浸提液的量不足以萃取出全部的ITCs，提取率較低；浸提料液比過高時1:30 g/mL，不僅增加了緩沖液的用量，也沒有有效提高ITCs的提取得率。因此，確定最佳浸提料液比在1:20 g/mL左右。

圖6 浸提料液比對ITCs提取率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of ITCs

2.2 響應面試驗優化結果分析

2.2.1 響應面試驗分析 從單因素實驗結果可知，酶解時間、溫度、pH對ITCs的提取率影響更為顯著，因此選取這三個酶解因素作為響應面實驗因素進行優化。根據Box-Bohnken中心組合設計原理，設計三因素三水平的響應面分析試驗，17個實驗組結果如表2所示。

表2 響應面試驗數據Table 2 Response surface experimental data

2.2.2 二次回歸方程模擬及方差分析 用DesignExpert 9.0軟件對表2中的實驗結果進行分析后得到二階響應表面模型方程：

對回歸方程進行方差分析，結果如表3所示，顯著性結果以P值表示，模型顯著性檢驗P＜0.05，表明該模型具有統計學意義。失擬項用來表示所用模型與實驗擬合的程度，即二者差異的程度，失擬項P=0.0703＞0.05，表明失擬不顯著。模型決定系R2=0.9835，說明該模型擬和程度良好，實驗誤差小，該模型能夠較好地描述各因素與響應值之間的真實關系。模型的校正決定系數R2adj=0.9624，說明該模型能解釋約96%響應值的變化；

t檢驗和P值用于確定每個因素對ITCs提取率產生的影響。P值用作檢查每個系數顯著性的工具，數值越小，相應系數的顯著性就越強。從表3中可知，二次項A2、B2、C2和交互項BC對ITCs的提取率均呈極顯著性影響（P＜0.01），交互項AB、BC呈顯著性影響（P＜0.05），三個因素對指標影響大小順序為B＞A＞C。

利用上述回歸方程確定最佳提取工藝條件：酶解時間3.95 h，酶解溫度44.6 ℃，pH 6.52，在此條件下，進行驗證試驗，重復三次，ITCs提取率為8.36 mg/g，回歸模型預測理論ITCs提取率為8.51 mg/g，驗證值略低于預測值，其相對誤差為1.80%，因此回歸方程是可用的。

表3 模型的方差分析Table 3 Anova analysis for the response variables

2.2.3 各因素交互作用分析 回歸方程顯示，各因素之間存在著一定的交互作用，圖7～圖9的響應面圖反映了各因素在酶解過程中對響應值的影響，其投影為等高線圖。響應面圖坡度的陡峭程度直觀地反映了各因素對響應值的影響，結果與表3中交互項的顯著性一致。

圖7 Y=f（A，B）的響應面Fig.7 Responsive surface plot Y=f（A，B）

圖8 Y=f（A，C）的響應面Fig.8 Responsive surface plot Y=f（A，C）

圖9 Y=f（B，C）的響應面Fig.9 Responsive surface plot Y=f（B，C）

2.3 酶解產物的GC-MS分析結果

通過GC-MS分析了最佳酶解條件下制備的ITCs樣品。選擇峰面積作為總ITCs提取相對含量的分析信號，并將MS譜圖與NIST標準質譜庫進行比對，譜庫檢索結果匹配度達95%以上的物質中，鑒定出5種酶解相關化合物，分別是4-（甲硫基）丁腈、1-異硫代氰酸丁酯、蘿卜硫腈、噁唑烷硫酮、蘿卜硫素，整理見表4。其中，異硫氰酸酯類主要活性物質蘿卜硫素在7.42 min被檢測到，其得率也最高。從圖10和圖11可以看出，該活性產物的質譜圖與NIST譜庫中蘿卜硫素的譜圖（圖12）吻合，其特征峰72、160與譜庫中蘿卜硫素的匹配度達98%以上，本實驗檢測結果也與Gu等[15]的研究結果是一致的。

表4 GC-MS測定結果Table 4 GC-MS measurement results

圖10 GC-MS總離子流圖Fig.10 GC-MS total ion current diagram

圖11 保留時間7.42 min的質譜圖Fig.11 Mass spectrum at retention time 7.42 min

3 結論

通過單因素和響應面試驗研究了各因素對ITCs提取率的影響，綜合考慮各方面的因素，最終確定西蘭花種子中ITCs的最佳酶解提取條件：最適pH為6.52，酶解溫度為44.6 ℃，酶解時間為3.95 h，ITCs的理論提取率為8.51 mg/g，經實驗驗證ITCs的提取率為8.36 mg/g，其相對誤差為1.8%。在此基礎上，對酶解產物進行了GC-MS分析，鑒定出異硫氰酸酯類相關化合物共五種，分別為有4-（甲硫基）丁腈、1-異硫代氰酸丁酯、蘿卜硫腈、噁唑烷硫酮、蘿卜硫素，其中目標產物蘿卜硫素的相對含量最高，表明該工藝條件用于西蘭花種子中異硫氰酸酯的提取是可行的，對于進一步研究、應用、開發ITCs相關產品具有現實意義。

圖12 NIST譜庫中的蘿卜硫素譜圖Fig.12 Mass spectrogram of sulforaphane in the NIST library