新疆棉花莖腐病的病原鑒定及其生物學特性研究

孫璘，海艷，唐曉雪，祖麗皮亞·艾買，焦瑞蓮，任毓忠*，李國英*

（1.石河子大學農學院/新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室，新疆石河子832003；2.石河子市種子管理站，新疆 石河子832000）

2016年以來，在新疆棉花上發現了1種引起棉花莖稈腐爛的病害，對病部進行鏡檢，發現大量鐮刀菌分生孢子。該病害在田間主要為害莖稈，嚴重時往往導致棉花整株枯死。

國內外關于棉花莖腐病的報道不多，1975年西安市植保植檢站報道的棉花莖腐病病原菌是Phomasp.[1]。1986年李慶基等在《菜豆殼球孢菌與棉花的關系》中提到Macrophom ina phaseoli可導致棉花莖腐病[2]。1996年方中達在《中國農業植物病害》上記載棉花莖腐病病原為Sclerotium rolfsii[3]。2000年Koenning等和Laidou等分別報道Phoma exigua和Alternaria alternata可引起棉花莖腐病的發生[4-5]。以上病原均不是鐮刀菌。1977年蘇聯學者比托普利契科在《栽培作物真菌病原鑒定》一書中報道，爪哇鐮孢（F.iavanicum）和黃色鐮孢（F.culmorum）可引起棉花莖部病害[6]，但這2個種和本研究發現的新疆棉花莖腐病病原有明顯的區別。

鐮刀菌是一種分布十分廣泛的微生物，不僅可以造成許多農作物的病害，部分鐮刀菌還會產生毒素，污染環境，危害人類健康[7]。其對環境的適應能力強，容易變異，導致其種的鑒定存在一定困難[8]。隨著分子生物學的不斷發展，分子診斷技術已廣泛應用于真菌的種類鑒定以及種間遺傳分化分析。由于新疆棉花莖腐病病原并未明確，該病害如遇到適宜環境流行并成災，故本研究通過形態學特征、核糖體內轉錄間隔區（rDNA-Internally transcribed spacer sequences，rDNA-ITSs）和轉錄延伸因子1α（Transcriptional elongation factor 1-alpha，TEF-1α）基因序列分析和致病性測定對病原種類進行鑒定，進一步測定病原生物學特性，以期為該病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病害調查、采樣和癥狀描述

該病于2016年8月底在棉田病害普查時發現。于2017年8月下旬和2020年9月中旬分別在南疆阿拉爾棉田及北疆石河子棉田和博爾塔拉蒙古自治州棉田對該病的發生情況進行了初步調查，并在11個地點對典型病樣進行了采集、拍照和癥狀描述。

1.2 病原的分離、純化和代表性菌株的選擇

將南北疆棉田所采18個病樣的莖稈經流水沖洗12 h，晾干后于超凈工作臺內用滅菌解剖刀在發病與健康部位交界處直接切取5 mm×5 mm的病樣，在質量分數為0.1%升汞中浸泡20 s后用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干，然后置于馬鈴薯蔗糖瓊脂（Potato sucrose agar，PSA）培養基上，恒溫25℃暗培養3 d。根據采集地點、菌落特點和形態特征選取20個代表性菌株（表1）進行單孢純化并于PSA培養基上4℃保存待用。

1.3 病原的鑒定

1.3.1形態學鑒定。按照Booth[7]、Nelson等[8]和Leslie等[9]的分類系統對鐮刀菌各形態特征進行歸納匯總，結合王拱辰等發表的《常見鐮刀菌鑒定指南》[10]對病原進行形態學鑒定。依據大分生孢子的形態特征，小分生孢子的有無、形態和著生方式，分生孢子梗的特征，厚垣孢子的有無，菌落的顏色特征及其生長速率進行鑒定。將20個菌株分別移接至PSA和合成低營養瓊脂（Synthetic low nutrient agar，SNA）（KH2PO41 g、KNO31 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、葡萄糖0.2 g、蔗糖0.2 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L）培養基上。在PSA培養基上恒溫25℃暗培養5 d后觀察其菌落形態，7 d后分別測量50個大分生孢子、50個小分生孢子和50個厚垣孢子；在SNA培養基上，觀察大、小分生孢子形態及分生孢子梗和分生孢子的著生狀態，并拍照。

表1 代表性菌株樣品編號及其采集時間和地點Table 1 Number,collection time and location of the strain sam ples

1.3.2分子生物學鑒定。將20個供試菌株在PSA培養基上培養7 d后，用無菌解剖刀將其菌絲刮至2 m L離心管中。使用Bio Flux真菌DNA提取試劑盒提取供試菌株的基因組DNA。使用鐮刀菌屬rDNA-ITSs特異性引物（ITSF、ITSR）、真菌ITSs區（ITS1、ITS4）和TEF1α（TEF-lαF、TEF-1αR）的通用引物（表2）對供試菌株DNA進行聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）擴增。反應程序均為94℃預變性5 m in，94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸30 s，35個循環，72℃再次延伸7 m in。PCR產物經質量分數為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工生物有限公司測序。測序結果至BLAST比對和分析，下載相似性高且同時含有rDNA-ITS和TEF-1α基因的鐮刀菌屬（Fusariumspp.）參考菌株的序列。按照rDNA-ITS和TEF-1α的順序依次拼接，并以棉花黃萎病病原菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）為外群，使用MEGA5.0軟件中鄰接法（Neighbor-joining method）構建系統發育樹，參數設置如下：Bootstrap method（Test of phylogeny）檢驗迭代1 000次，Maximum composite likelihood（substitution model），Uniform rates（Rates among sites），Complete deletion（Gaps/m issing data treatment），1st＋2nd＋3rd＋non-coding（codons included）。

表2 引物及其序列信息Table 2 Primers and their sequence information

1.3.3致病性測定。致病性測定選用棉花品種均為石惠16號，接種時期為花鈴期，接種區三面均為棉花，一面為道路，確定周圍沒有造成類似癥狀的污染源和工廠。以形態學鑒定和分子生物學鑒定為基礎，選取2種代表性菌株F3和F11，分別代表F.proliferatum和F.incarnatum，用噴霧法和菌絲塊法接種，進行致病性測定。噴霧接種：按照常規方法配制孢子含量1×107m L－1孢子懸浮液，在田間分別用無傷、有傷（針刺）[14]對莖稈和棉鈴進行接種，然后套袋保濕72 h，每組處理15個莖稈和棉鈴，以不接種的莖稈和棉鈴為對照。定期調查發病情況，比較不同接種方法的發病癥狀。菌絲塊接種：在菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅，分無傷、有傷（針刺）接種到莖稈和棉鈴上，每組處理15個莖稈和棉鈴，以不接種莖稈和棉鈴為對照。持續觀察15 d，比較不同接種方法的發病癥狀。另外，對棉花苗期進行致病性測定，所用棉花品種為新陸早66號，在幼苗長至3～5葉期采用針刺噴霧接種莖稈，接種孢子含量和上述相同，接種1個月后，觀察莖稈發病情況，以未接種的莖稈為對照。發病后對顯癥部位進行再分離，觀察再分離菌株與接種菌株異同。

1.4 2種鐮刀菌生物學特性觀察試驗

1.4.1溫度試驗。2種鐮刀菌培養6 d后，在無菌條件下從菌落的邊沿用滅菌打孔器打成直徑5mm的菌餅，供如下生物學特性測定使用。分別將2種鐮刀菌菌餅移接至PSA培養基上，置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃的恒溫箱中進行黑暗培養。5 d后測量菌落直徑并拍照。7 d后測定產孢量，即分別在F.incarnatum和F.proliferatum的培養皿中加入1 m L和5 m L無菌水，充分混合均勻，得到孢子懸浮液，然后用血球計數板按常規操作測定產孢量。每種處理設置3個重復。

1.4.2光照試驗。將2種鐮刀菌菌餅移接至PSA培養基上，分別放入全黑暗、全光照和光暗交替（12 h∶12 h）3種處理的恒溫箱中，25℃恒溫培養。5 d后測量菌落直徑并拍照，7 d后使用血球計數板按常規方法測定產孢量。每種處理設置3個重復。

1.4.3pH試驗。用HCl和NaOH將PSA培養基的pH分別調為4、5、6、7、8、9、10，將2種鐮刀菌菌餅移接至不同pH的PSA培養基上，25℃恒溫黑暗培養。5 d后測量菌落直徑并拍照，7 d后使用血球計數板按常規操作測定產孢量。每種處理設置3個重復。

1.4.4培養基試驗。將2種鐮刀菌菌餅分別移接至PSA培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養基、（索萊寶）麥芽汁瓊脂（Malt extract agar，MEA）培養基、SNA培養基、VBC培養基[15]、燕麥瓊脂（Oatmeal agar，OA）培養基、玉米粉瓊脂（Corn meal agar，CMA）培養基上，25℃恒溫黑暗培養。5 d后測量菌落直徑并拍照，7 d后使用血球計數板按常規操作測定產孢量。每種處理設置3個重復。

1.4.5致死溫度測試。將2種病原菌分別配制成孢子含量1×107m L－1的孢子懸浮液，每離心管中各裝入1 m L。分別制取2種病原菌菌餅（直徑5 mm），每離心管裝入6個。將孢子懸浮液及裝有菌餅的離心管分別置于40、45、50、55、60和65℃的恒溫水浴鍋內處理10 m in。自然冷卻至室溫后，立即移接至PSA培養基上，并于恒溫25℃的人工氣候培養箱黑暗培養3 d后，根據病原菌是否生長確定致死溫度范圍。然后以1℃為間隔設置溫度梯度，重復上述步驟，確定致死溫度。

1.5 數據分析

各試驗處理均為3次重復，數據經MSExcel 2010計算平均值及標準差，使用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析和多重比較[最小顯著差數法（Least significant difference，LSD）]。

2 結果與分析

2.1 田間病害調查結果及癥狀描述

調查查明，該病在南北疆棉田都有發現，雖發生范圍較廣，但在田間主要呈零星分布，一般在生長比較衰弱的棉株上較易發生。經調查，該病主要侵染棉花植株主莖和側枝結合部，侵染初期在病部產生褐色的小點，在濕度較大的情況下，病斑擴展較快，并在病部產生一層白色或淡紅色粉狀的霉層（病征），嚴重時病部組織崩潰，植株枯死；干燥情況下病斑擴展較慢，甚至停止擴展，不產生霉層，僅為不規則形或梭型的褐色斑點或斑塊。

2.2 病原鑒定結果

2.2.1形態學鑒定。分離菌株的主要形態特征：菌落呈棉絮狀或羊毛狀，初期均為白色至粉紅色，后期為淺駝色或淡青蓮色；大型分生孢子鐮刀狀，小型分生孢子紡錘狀或卵狀。根據采集地點、菌落特點和形態特征選取20個代表性菌株。依據上述特征將其初步確定為鐮刀菌屬。根據菌落特征、大分生孢子和小分生孢子特征將其分為2類。

本試驗通過對精密度、穩定系、重復性進行方法學考察，共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于5%，這一結果表明該方法符合建立中藥指紋圖譜的技術要求。利用高效液相色譜建立了29個品種的棗葉的物質指紋圖譜，標定了14個共有峰，使用中藥指紋圖譜軟件進行分析，結果表明不同樣品之間相似度存在差異，根據相似度的大小，可以將不同品種的棗葉的質量分為三個等級。對29個品種棗葉的成分含量進行聚類分析，可將29 批棗葉分為三類，結果與相似度結果一致，說明本文所建立的指紋圖譜具有較好的穩定性與重復性，可以用于棗葉的質量控制，為棗葉資源的綜合利用提供參考。

第一類：菌株F5、F6、F11～F20在PSA培養基上的生長速率為12.28～13.67 mm·d－1。菌落氣生菌絲白色棉絮狀，培養初期培養基表面白至粉紅，后變淺駝色（圖1-A1）。大分生孢子較多，鐮刀形、紡錘形，具有明顯的足細胞，具3～7個分隔，大小為（10.50～41.99）μm（平均為28.44μm）×（2.77～6.83）μm（平均為4.58μm）（圖1-A2）；小分生孢子較少，紡錘形，有時稍彎曲，具0～2個分隔，大小為（6.32～13.21）μm（平均為10.05μm）×（2.32～3.87）μm（平均為3.05μm）（圖1-A3）；單瓶梗產孢細胞和多芽產孢細胞并存（圖1A4）。厚垣孢子近圓形，大小為（5.75～8.94）μm（平均為7.31μm）×（5.84～9.85）μm（平均為7.51μm）（圖1-A5）。形態特征和變紅鐮刀菌F.incarnatum一致。

第二類：菌株F1～F4、F7～F10在PSA培養基上的生長速率為11.86～13.07 mm·d－1。菌落氣生菌絲白色羊毛狀，培養初期培養基表面白至粉紅，后變淡青蓮色（圖1-B1）。大分生孢子較少，鰻形或鐮刀形，筆直或接近筆直，具3～5個分隔，大小為（19.77～41.83）μm（平均為30.20μm）×（3.21～7.17）μm（平均為4.13μm）。小分生孢子極多，卵形、瓜子形或腎形，具0～1個分隔，大小為（3.92～13.05）μm（平均為8.34μm）×（2.17～3.85）μm（平均為2.98μm）（圖1-B2）。產孢細胞單瓶梗和復瓶梗并存，小分生孢子單生或假頭狀著生（圖1-B3），未見厚垣孢子。形態特征和層出鐮刀菌F.proliferatum一致。

2.2.2分子生物學鑒定。供試20個菌株采用鐮刀菌屬特異性引物均可擴增出431 bp的片段，確定均為鐮刀菌屬。采用真菌通用引物ITS1/ITS4對供試菌株DNA進行PCR擴增，在NCBI進行Blast對比得出：第一類菌株（菌株F5、F6、F11～F20）擴增產物與F.incarnatum（登錄號GQ505704.1、GQ505680.1、KF255427.1和KF255432.1）相似性為99.23%～99.81%；第二類菌株（菌株F1～F4、F7～F10）ITS區擴增產物與F.proliferatum（登 錄 號KR071679.1、KR071678.1、JX162388.1和JX162373.1）相似性為97.84%～99.79%。菌株rDNA-ITS基因序列長度及其登錄號見表3。

采用引物TEF-lαF/TEF-lαR進行擴增，鑒定得出：第一類菌株（F5、F6、F11～F20）擴增產物與F.incarnatum（登錄號GQ505615.1、GQ505591.1、KF255470.1和KF255476.1）相似性為91.31%～99.85%；第二類菌株（F1～F4、F7～F10）擴增產物與F.proliferatum（登錄號KR071738.1、KR071736.1、JX118998.1和JX118983.1）相似性為99.26%～100.00%。菌株TEF-lα基因片段長度及其登錄號見表4。

圖1 菌株形態Fig.1 Morphology of the strains

對供試菌株進行ITS/TEF-1α聯合序列構建系統發育樹（圖2）。第一類菌株（F5、F6、F11～F20）均與F.incarnatum聚在同一個分枝上；第二類菌株（F1～F4、F7～F10）均與F.proliferatum聚在同一個分枝上。根據病原菌的形態特征和分子生物學結果確定供試菌株為2類：第一類菌株（F5、F6、F11～F20）為F.incarnatum；第二類菌株（F1～F4、F7～F10）為F.proliferatum。

2.2.3致病性。致病性測定結果表明：F11（F.incarnatum）在無傷接種條件下，采用菌絲塊接種莖稈，莖稈接種處產生紫紅色或褐色斑點，病斑逐漸擴大至黑褐色，病部凹陷且表皮壞死（圖3-B）；有傷接種條件下，分別采用孢子懸浮液和菌絲塊接種均可使莖稈和棉鈴發病。其發病癥狀為莖稈和棉鈴接種處產生褐色小點，后不斷擴大成黑褐色斑點，病部凹陷。另外，菌絲塊接種較其孢子懸浮液接種發病早、病情也較重，莖稈病部縱裂導致木質部外露，發病后期在潮濕條件下會產生一層開始白色（菌絲體）后呈粉紅色（分生孢子梗和分生孢子）的粉狀霉層；干燥情況下，病部則不產生粉紅色粉狀霉層，嚴重時莖稈完全枯死（圖3-C～F）。接種株癥狀和田間病株癥狀一致（圖3-A）。菌株F3（F.proliferatum）接種后癥狀與F11（F.incarnatum）相同。無傷噴霧接種均不發病，對照均不發病。苗期針刺噴霧接種后也明顯發病，癥狀和成株期接種的癥狀基本相同，對照均不發病。

表3 菌株rDNA-ITS基因序列長度及其登錄號Table 3 The length and accession number of rDNA-ITS gene sequence of strains

表4 菌株TEF-lα基因序列長度及其登錄號Table 4 The length and accession number of TEF-lαgene sequence of strains

2.3 2種鐮刀菌的生物學特性

2.3.1溫度對2種鐮刀菌生長和產孢量的影響。變紅鐮刀菌（F.incarnatum）在10～30℃均可生長，在5℃以下和35℃以上不生長。層出鐮刀菌（F.proliferatum）在10～35℃均可生長，在5℃以下不生長。在10～25℃下，二者菌落生長速率均隨溫度升高而加快；高于25℃時，隨溫度的升高而變慢。兩者最適宜生長溫度均為25℃左右，在此溫度條件下，5 d后菌落直徑分別可達62.62 mm和60.28 mm。溫度對二者菌落形態影響不大。兩者的適宜產孢溫度略有不同，且產孢量差異較大。F.incarnatum在15～30℃均可產孢，適宜產孢溫度為25～30℃，產孢量可達到1.4×106m L－1；而F.proliferatum在10～35℃均可產孢，最適產孢溫度為25℃，產孢量可達到2.56×107m L－1，明顯大于F.incarnatum（表5）。

圖3 田間與接種發病癥狀Fig.3 Symptom s of disease in field and inoculation

2.3.3pH對2種鐮刀菌生長和產孢量的影響。二者在pH 4～10下均可生長、產孢。其最適生長pH均為8，在此pH下F.incarnatum和F.prolif eratum菌落直徑分別可達到63.27 mm和64.97 mm；其最適產孢pH均為7，在此pH下其產孢量分別可達到1.33×106m L－1和1.8×107m L－1（表5）。

2.3.4培養基對2種鐮刀菌生長和產孢量的影響。二者在7種供試培養基上均可生長（表5）。F.incarnatum在PDA培養基上生長最快，培養5 d后菌落直徑可達67.48 mm；在VBC培養基上生長較慢，培養5 d后菌落直徑僅達40.90 mm；最適產孢培養基為PSA，產孢量可達1.27×106m L－1。F.proliferatum在PSA培養基上生長最快，培養5 d后菌落直徑可達到64.35 mm；在VBC培養基上生長較慢，培養5 d后菌落直徑僅達到48.77 mm；最適產孢培養基為PDA，產孢量可達2.69×107m L－1。二者在CMA培養基上產孢量最小。在VBC和SNA培養基上，兩者大分生孢子隔膜更加清晰，頂部和基部更易區分，足細胞更加明顯。

2.3.52種鐮刀菌的致死溫度。將F.incarnatum孢子懸浮液于48℃水浴鍋處理10 m in后，孢子不再萌發，因此確定F.incarnatum孢子致死溫度為48℃。將含有F.incarnatum的菌餅放入50℃水浴鍋處理10 min后，菌絲不再生長，因此確定F.incarnatum菌絲的致死溫度為50℃。采用同樣方法確定，F.proliferatum孢子的致死溫度為60℃，菌絲致死溫度為61℃。

表5 不同培養條件（溫度、光照、pH）和培養基種類下菌落生長和產孢量的比較Table 5 Comparison of colony grow th and spore production in different culture conditions(tem perature,light,pH)and cultural media

3 討論

根據柯赫氏法則，初步確定引起新疆棉花莖腐病的病原有2種，即變紅鐮刀菌（F.incarnatum）和層出鐮刀菌（F.proliferatum）。經接種試驗還發現，這2種菌不僅可引起莖腐，還可引起棉鈴發病。據報道，這2種菌寄主范圍都較廣泛，不僅可引起植物枯萎、根腐、莖腐、果腐和穗腐等，而且還可產生伏馬菌素造成環境污染和人畜疾病[16-18]。國內外主要報道過玉米、水稻、甜瓜等受這2種鐮刀菌危害嚴重[16-18]；但這2種鐮刀菌對棉花的危害此前未見報道，因此由其引起的棉花莖腐病是我國首次發現。

經鑒定，供試的20個代表性棉花莖腐病菌株中，有變紅鐮刀菌12個，占供試菌株60%；有層出鐮刀菌8個，占供試菌株40%，說明變紅鐮刀菌為引起新疆棉花莖腐病的優勢菌株。從這2種鐮刀菌的形態特征可以看出，本研究中的F.incarnatum與王燕等[18]在甜瓜果腐病上所分離的該種鐮刀菌在形態上較一致，差異在于本研究供試菌株可以產生厚垣孢子；Wonglom等[19]報道的哈密瓜果腐病菌F.incarnatum雖可產生厚垣孢子，但其大分生孢子稍彎且足細胞較細長：這些形態差異可能與寄主和環境不同有關。F.proliferatum形態特征與Nelson等[8]報道一致。另外，南疆阿拉爾棉區所采3個菌株均為F.proliferatum，那么是否意味著南疆棉花莖腐病的病原以此為主？因采樣較少，這有待今后研究驗證。

由于鐮刀菌的培養特性變化較大，培養時又存在不產孢或性狀不典型等現象，特別是一些形態上相近的種，僅從形態鑒定存在一定困難，因此需要結合分子生物學進行鑒定。本研究采用真菌rDNA-ITS區和TEF-1α區的通用引物對供試菌株DNA進行PCR擴增。結果表明，ITS對親緣性相近的物種分辨率不夠高，而采用TEF-1α序列分析可以確定鐮刀菌的“種”級關系。另外，從系統發育樹可以看出，同種鐮刀菌同源性很高，不同種間同源性較低，進一步說明了鐮刀菌種間遺傳分化水平高的特點。

生物學特性研究表明，供試F.incarnatum在10～30℃均可生長，20～30℃下生長較快；最適生長、產孢pH分別為8和7。該特性與甜瓜果腐病的相同病原菌報道[18]相似。與甜瓜果腐病菌[18]相比，本研究供試菌株生長速率更快，但產孢量和致死溫度較低。另外，全光照處理有利于供試F.incarnatum生長，不利于其產孢；但王燕等[18]報道的甜瓜果腐病菌F.incarnatum在不同光照處理下生長和產孢無顯著性差異。以上結果說明F.incarnatum不同菌株間存在明顯的生物學特性差異，這可能與寄主有關。F.proliferatum在10～35℃均可生長，20～30℃下生長較快；在pH 7～10下生長無顯著性差異；最適生長、產孢pH分別為8和7；在不同光照條件下，其生長無顯著性差異，這與王明道等[20]報道的層出鐮刀菌的生物學特性基本相同。另外，PSA和PDA培養基有利于2種鐮刀菌的生長和產孢；通過SNA和VBC培養基可誘導大孢子的產生，以便觀察到更典型的孢子形態，即大型分生孢子隔膜更加清晰，頂部和基部更易區分，足細胞更加明顯。

4 結論

對南北疆病樣進行組織分離、單孢純化，根據形態學鑒定、分子生物學鑒定以及致病性測定將引起新疆棉花莖腐病的病原確定為變紅鐮刀菌（F.incarnatum）和層出鐮刀菌 （F.proliferatum）。不同條件的培養試驗結果表明：這2種病原菌最適生長和產孢溫度均為25℃；光照有利于F.incarnatum生長，但不利于其產孢，而F.proliferatum在不同光照條件下菌落生長無顯著性差異；黑暗培養有利于二者產孢；二者生長的最適pH均為8，產孢的最適pH均為7；F.incarnatum和F.proliferatum孢子的致死溫度分別為48℃、60℃，菌絲的致死溫度分別為50℃、61℃；PSA和PDA培養基有利于二者生長和產孢，而VBC和SNA培養基適用于二者形態學觀察。