土壤環境因子對棉花根際與內生拮抗細菌存活數量的影響

黨文芳，劉萍，管力慧，楊紅梅，牛新湘，李萍，楚敏，婁愷，史應武,3,6*

（1.新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊830091；2.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊830052；3.新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊830091；4.新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所，烏魯木齊830091；5.新疆庫爾勒市農業技術推廣站，新疆庫爾勒841000；6.農業農村部西北綠洲農業環境重點實驗室，烏魯木齊830091）

隨著對生防微生物防病機制研究的不斷深入，生防微生物在農田的高效應用及其適應土壤生境的生態學條件研究已成為熱點[1-5]。其中，生防微生物的生防效果取決于生防微生物菌劑應用的生態環境條件及相應農作物的長勢等觀點已經明確。因此，篩選出適應當地生態環境的生防微生物菌株，并通過研究土壤環境對外源施入生防微生物群落結構的影響，對生防微生物菌劑的合理開發和高效應用具有重要的理論指導價值[6]。

目前，有關生防微生物的適應性研究多限于探討其在植物植株中的定植變化規律及其定植后對植物生長的影響和防病效果的研究，對復雜的土壤環境的適應性及與其宿主相關性的報道還很少見，而生防微生物與復雜的農田環境的關系決定了生防微生物的定植能力，進而影響防治病害的效果及其田間實際應用價值[7-13]。筆者團隊[14-15]前期從新疆棉田土壤中篩選出4個棉花黃萎病病原菌大麗輪枝菌（Verticillium dahilae）的拮抗細菌菌株，鑒定為BacillusvelezensisBHZ-29（貝萊斯芽孢桿菌BHZ-29）、B.subtilisSHT-15（枯草芽孢桿菌SHT-15）、B.atrophaeusSHZ-24（萎縮芽孢桿菌SHZ-24）和B.vanilleaSMT-24（香草芽孢桿菌SMT-24）；與大麗輪枝菌共培養發現，4個菌株能通過減少大麗輪枝菌分生孢子形成、破壞大麗輪枝菌菌絲和孢子形態、導致大麗輪枝菌細胞膜破裂和降低大麗輪枝菌毒蛋白的含量等達到抑制病原菌的作用。王娜等[16]指出不同內生細菌在棉花體內的定植規律不同，且在棉苗中定植一定數量后才能對棉花黃萎病產生較高的防治效果。高毓晗等發現枯草芽孢桿菌168被修復基因后其定植能力顯著上升，對番茄細菌性枯萎病和黃瓜鐮刀菌枯萎病的防效大幅上升[17-18]。據此，研究4個菌株在土壤環境中的適應能力有助于發揮其防治棉花黃萎病的潛力。

為了充分發揮這4個菌株的應用效果，本研究以此為研究對象，在實驗室條件下分析土壤理化性質對其存活數量及活性的影響，揭示拮抗細菌在土壤不同理化條件下的適應能力，為這些菌株進一步高效防治棉花黃萎病應用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1土樣。取自博樂（BL）、石河子（SHZ）、庫爾勒（KEL）試驗地土壤。土壤的理化性質由中國科學院新疆生態與地理研究所測定。

表1 不同采樣地土壤理化性質Table 1 Soil physical and chem ical properties in different sam pling sites

1.1.2供試病原菌。大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）菌株為2015-007，系強致病力菌株[19]，由新疆農業科學院植物保護研究所饋贈。

1.1.3供試拮抗細菌。供試菌株均由新疆農業科學院微生物應用研究所史應武研究員課題組篩選得到。其中，BHZ-29、SHZ-24分別從博樂、石河子棉株內篩選得到，SHT-15、SMT-24均從石河子棉株根際土壤中獲得。

1.1.4供試棉花品種。新陸早36號由新疆石河子農業科學院棉花研究所饋贈。

1.1.5供試培養基。采用4種培養基試驗，即營養肉湯（Nutrient broth,NB）培養基、營養瓊脂（Nutrient agar,NA）培養基，查比克（Czapek）培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextroseagar,PDA）培養基。

1.1.6主要試劑。試劑包括尿素、磷酸二銨（二銨）、硫酸鉀、碳酸鈉、重碳酸鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、硫酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉。以上試劑均為化學純試劑。配制0.85%（質量分數）氯化鈉溶液。

1.1.7主要儀器。恒溫培養振蕩器ZHWY-211B型由上海智誠分析儀器制造有限公司生產，超凈工作臺SWCGCO型由蘇州凈化設備有限公司生產，SPX-250BF-2型培養箱由上海福瑪實驗設備有限公司生產，YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器由上海博迅實業有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1土樣的滅菌。同文獻[14]。

1.2.2病原菌發酵液制備。同文獻[14]。

1.2.3拮抗細菌發酵液制備。同文獻[14]。

1.2.4培養皿中理化因子試驗方法。試驗（1）～（5）以灰漠土為基礎進行，量取病原菌1 m L、拮抗細菌3 m L，按照試驗設計加入定量滅菌水或混合液于培養皿（直徑為90 mm）中，搖勻后再稱取40 g滅菌土于培養皿中，放入培養箱進行培養（30℃），每隔一段時間取土樣進行拮抗細菌的活菌計數。試驗開始后，每天下午18：00用稱量法測定土壤含水量，補充當天失去的水分，使各處理保持設定的含水率。

6個土壤理化因子的試驗設置如下：（1）3個水分梯度，分別量取10 m L、15 m L、20 m L滅菌水于培養皿中。（2）3個溫度梯度，分別為15℃、25℃、30℃，放入培養箱中。（3）3個鹽分梯度，含鹽量（質量分數）分別為0%、0.3%、0.6%（由碳酸鈉、重碳酸鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、硫酸鈉7種鹽分等比例混入蒸餾水中滅菌后使用）。（4）3個肥力梯度，分別為T1、T2、T3，按1 kg土添加如下肥料，T1：尿素0.048g，二銨0.073g，硫酸鉀0.012 g；T2：尿素0.077 g，二銨0.128 g，硫酸鉀0.026 g；T3：尿素0.104 g，二銨0.182 g，硫酸鉀0.052 g。上述肥料混入蒸餾水中滅菌后使用。（5）3個pH梯度，用NaOH或鹽酸分別調滅菌水pH至5、7、9。（6）3個土壤類型，棕漠土（ZMT，取自新疆庫爾勒試驗地）、灰漠土（HMT，取自新疆石河子試驗地）、棕鈣土（ZGT，取自新疆博樂試驗地）。

這6個土壤理化因子每個梯度下，用1.2.2的病原菌發酵液（孢子含量107m L－1）與1.2.3的拮抗細菌發酵液[有效活菌數108CFU（菌落形成單位，Colony form ing unit）·m L－1]設置以下8個處理，每個處理3個重復，每皿為1個重復，共有432個培養皿。8個處理：（1）拮抗細菌SHZ-24發酵液；（2）拮抗細菌SHT-15發酵液；（3）拮抗細菌SMT-24發酵液；（4）拮抗細菌BHZ-29發酵液；（5）病原菌發酵液＋拮抗細菌SHZ-24發酵液；（6）病原菌發酵液＋拮抗細菌SHT-15發酵液；（7）病原菌發酵液＋拮抗細菌SMT-24發酵液；（8）病原菌發酵液＋拮抗細菌BHZ-29發酵液。

1.2.5盆栽中土壤理化因子試驗方法。試驗（1）和（2）以灰漠土為基礎進行，設置3個土壤理化因子：（1）3個水分處理。每隔1 d澆1次水，每缽10 m L；每隔2 d澆1次水，每缽10 m L；每隔3 d澆1次水，每缽澆10 m L。每隔3 d、2 d和1 d（每缽10 m L水）處理的土壤的含水率分別為10%、15%和20%。（2）設3個肥力處理，T1、T2、T3，肥料配方同1.2.4。施用時將肥料溶入水中澆灌棉苗，施用前將肥料溶入水，分4次灌入土壤：30%作基肥，1片真葉時施20%，棉苗生長15 d時施30%，棉苗生長30 d時施20%。試驗期間各處理均灌溉無離子水。（3）3個土壤類型，分別為采自新疆庫爾勒（棕漠土）、石河子（灰漠土）、博樂（棕鈣土）的土壤。土壤滅菌后進行盆栽試驗。

棉苗盆栽種植及防效試驗方法：將無菌土裝營養缽2/3處，每筒種植4粒顆粒飽滿的棉種，覆土后撫平表層土壤，放入智能培養箱出苗，晝/夜光照時間與溫度13 h/11 h、26℃/24℃，光照強度6×104lx，培養箱內相對濕度60%。用1.2.2的病原菌發酵液（孢子含量107m L－1）與1.2.3的拮抗細菌發酵液（108CFU·m L－1）設置7個處理。（1）空白處理；（2）僅傷根；（3）傷根＋病原菌發酵液；（4）傷根＋病原菌發酵液＋拮抗細菌SHZ-24發酵液；（5）傷根＋病原菌發酵液＋拮抗細菌SHT-15發酵液；（6）傷根＋病原菌發酵液＋拮抗細菌SMT-24發酵液；（7）傷根＋病原菌發酵液＋拮抗細菌BHZ-29發酵液。每個處理至少做3個重復。在播種一定時間后接種生防細菌和病原菌，調查防病效果。

1.2.6接種方法。播種后18 d左右棉苗1片真葉初現時，每缽棉苗接種拮抗細菌發酵液30 m L（直接將108CFU·m L－1注入棉株）。5 d后將長至兩葉一心的棉苗距根底部2～3 cm處用剪刀人工傷根，每缽棉株傷根處灌溉病原菌發酵液（孢子含量107m L－1）10 m L。棉苗置于智能培養箱中培養，每隔2 d澆1次水，每缽10 m L。白天培養箱內溫度控制在25℃，夜間溫度控制在22℃，土壤相對濕度控制在60%以上，光照良好。

1.2.7拮抗細菌在土壤生境中的活菌數量的測定。采用平板菌落計數法[20]計算土壤中拮抗細菌的數量。接種拮抗細菌后開始取樣，每個處理設3個重復，每個重復取3株棉苗根部土壤，挖取棉株根部土壤，混勻（培養皿取樣時，每皿選取3個部位挖取土壤），測量土壤的含水率后，稱量5 g土壤于250 m L三角瓶中，加入滅菌生理鹽水（質量分數為0.85%）45 m L，25℃、180 r·m in－1振蕩2 h，再用梯度稀釋法進行稀釋，將土壤原液稀釋至10-4、10-5梯度后涂布在NA固體培養基上，置于30℃恒溫箱培養1 d，記錄每皿細菌菌落數量，剔除雜菌并計算每克土壤中細菌數量。計算活菌數的相對數量（rN）：rN＝（N0－N1）/N0。式中，N0為對照組活菌數絕對數量，N1為試驗組活菌數絕對數量。

1.2.8防病效果調查。棉花黃萎病發生情況調查方法同文獻[15]。分級標準：0級，外表無癥狀；1級、2級、3級、4級，病葉占總葉片數比例分別為（0,25%]、（25%,50%]、（50%,75%]、（75%,100%]。病情指數（DI）計算公式：DI＝∑（DG×NDG）/（DGmax×NT）×100。式中，DG為病級，NDG為相應病級發病株數，DGmax為最高病級（4），NT為調查總株數。1.2.9數據處理與分析。采用MSExcel、Graph-Pad Prism 6和IBM SPSSStatistics 22軟件對數據進行分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 培養皿中土壤理化性質對拮抗細菌存活數量的影響

對培養10 d時不同理化因子下拮抗細菌的存活數量進行方差分析，結果（表2）表明，在6個土壤理化因子中，土壤含水率、土壤肥力和土壤類型對4株菌存活數量的影響均顯著（P＜0.05）；土壤pH、土壤含鹽量、土壤溫度對SMT-24、SHT-15和BHZ-29存活數量的影響顯著（P＜0.05），但對SHZ-24存活數量的影響不顯著（P＞0.05）。選擇對4株拮抗細菌影響均顯著的土壤因子進行盆栽試驗，進一步明確在不同土壤含水率、土壤肥力和土壤類型下4株拮抗細菌在棉苗根部的定植能力及對棉花黃萎病的防病效果。

2.2 盆栽土壤理化因子對拮抗細菌存活的影響

2.2.1土壤肥力對拮抗細菌相對數量的影響。在同一處理時間，不同土壤肥力處理下土壤中各菌株的活菌相對數量存在顯著差異 （P＜0.05）。BHZ-29菌株在3種土壤中活菌相對數量最高，T2肥力處理40 d時為24.81%，SHZ-24和SHT-15菌株次之，40 d時活菌相對數量分別為1.69%和1.83%；SMT-24菌株在土壤中活菌相對數量最低，T3、T2、T1肥力處理下40 d時分別為0.59%、0.92%和0.79%（圖1）。SHZ-24和SMT-24菌株在不同土壤肥力處理下活菌相對數量相差不大，SHZ-24在1.4%～2.8%，SMT-24在0.5%～1.3%。SHT-15菌株在整個時期內在T2肥力處理的土壤中活菌相對數量最高，10 d、20 d、30 d和40 d時分別達到了2.3%、1.77%、2.24%和1.83%，在整個監測時期內變化趨勢平穩。在T3肥力下10 d以后，BHZ-29菌株活菌相對數量呈先減小后增大的趨勢，T2肥力下呈先增大后減小的趨勢，T1肥力下呈持續減小的趨勢。BHZ-29菌株在整個時期內在T2肥力處理的土壤中相對數量最高。

2.2.2土壤類型對拮抗細菌相對數量的影響。在同一時間，不同土壤類型處理下土壤中各菌株的菌落相對數量存在顯著差異（P＜0.05）。在不同土壤類型中，BHZ-29菌株在土壤中活菌相對數量最高，棕漠土處理下40 d時為15.24%；SHZ-24和SHT-15菌株次之，棕鈣土中40 d時活菌相對數量分別為2.15%和3.07%；SMT-24菌株活菌相對數量在土壤中最低，灰漠土、棕鈣土、棕漠土肥力處理下40 d時分別為0.27%、1.06%和0.63%（圖2）。SMT-24菌株活菌相對數量在3種類型土壤中相差不大，其相對數量在0.5%～1.3%，在棕鈣土中均呈先增大后減小的趨勢。SHT-15菌株活菌相對數量在棕鈣土中呈先減小后增大的趨勢，在灰漠土和棕漠土中呈先增大后減小的趨勢。BHZ-29菌株活菌相對數量在灰漠土呈先增大后減小的趨勢，在棕鈣土和棕漠土中呈先減小后增大的趨勢，40d時分別達到13.32%和15.24%。

表2 4株拮抗細菌在不同土壤理化因子下的菌落存活數量方差分析結果Table 2 Analysis of the variance of the number of surviving antagonistic bacteria under different soil physical and chem ical factors

圖1 4株棉花黃萎病菌拮抗細菌在4種不同土壤肥力下的活菌相對數量變化Fig.1 Variation of the relative quantity of four antagonistic bacterial isolates against Verticillium dahliae in four different soil fertilities

2.2.3土壤含水率對拮抗細菌相對數量的影響。在同一時間，不同土壤含水率下土壤中各菌株的菌落相對數量存在顯著差異（P＜0.05）。在不同土壤含水率下，SHZ-24菌株在土壤中活菌相對數量最大，15%含水率下30 d時達到27.74%，且在20%和15%含水率下均呈現先減小后增大的趨勢；SHT-15菌株，在15%和20%含水率下活菌相對數量呈持續減小的趨勢，10%含水率下呈先減小后增大的趨勢，30 d時為10.85%；在3種含水率下，土壤中SMT-24菌株活菌相對數量相差不大；BHZ-29菌株在10%含水率的土壤中活菌相對數量呈先增大后減小的趨勢，且均高于含水率為15%和20%的土壤，在30 d時達到12.85%（圖3）。

2.2.4土壤肥力對拮抗細菌防效的影響。4株拮抗細菌在不同肥力處理后20 d時，棉苗在T3土壤中長勢良好，發病程度較弱；T2處理的棉苗發病較嚴重；T1處理的棉苗葉片出現萎蔫癥狀，發病最重。此時，同一拮抗細菌對棉花黃萎病的防效，在不同肥力處理間均表現顯著差異（圖4）。T3肥力處理4種拮抗細菌處理對棉花黃萎病的防效最好，SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29的防效分別為62.12%、63.64%、65.91%和87.12%；T1肥力處理下防效最差，分別為40.77%、44.89%、55.72%和53.87%；T2肥力處理下防效居中，分別為50.02%、51.59%、41.91%和66.89%。

2.2.5 土壤類型對拮抗細菌防效的影響。4株生防細菌處理后20 d時，不同土壤中棉苗子葉均已發病，部分真葉發病。此時，同一拮抗細菌對棉花黃萎病的防效在不同土壤類型間均表現顯著差異（圖5）。灰漠土中，SHZ-24和BHZ-29菌株防效最好，其防效分別達到了49.17%和44.75%；棕鈣土中，BHZ-29菌株防效最好，達到60.87%；棕漠土中，SHZ-24菌株的防效最好，達到45.50%。

圖2 4株棉花黃萎病拮抗細菌在3種類型土壤下的活菌相對數量變化Fig.2 Variation of relative quantity of four antagonistic bacterial isolates against Verticillium dahliae in three types of soil

2.2.6土壤含水率對拮抗細菌防效的影響。4株拮抗細菌處理后20 d時，含水率15%和20%處理的棉苗長勢良好，發病程度較弱；10%處理的棉苗葉片多數脫落，只剩頂端的2片真葉。此時，在不同土壤含水率下，同一拮抗細菌處理對棉花黃萎病的防效差異顯著（圖6）。在含水率10%和15%的條件下，拮抗細菌SHZ-24、SHT-15和BHZ-29防效較好，其中SHZ-24處理為53.74%和55.56%，SHT-15處理為52.76%和52.17%，BHZ-29處理為57.16%和58.45%。4株拮抗細菌在含水率為20%的土壤條件下相較其他2個含水率下棉花黃萎病的發病程度重。不同水分處理中，SMT-24菌株防效最差，10%、15%和20%的含水率下分別為35.04%、43.96%和37.55%。

3 討論

圖3 在不同土壤含水率下4株棉花黃萎病拮抗細菌的活菌相對數量變化Fig.3 Variation of the relative quantity of four antagonistic bacterial isolates against Verticillium dahliae in the soil with different water contents

多數植物病害的拮抗微生物是從土壤特別是植物根際土壤分離的，由于這些拮抗微生物易受土壤中各種條件的影響，在土壤中的存活能力差，導致其防病效果不穩定，無法達到持續防治的作用[21]。目前，有關拮抗微生物的防病機制研究著重在拮抗物質、營養和生態位競爭及系統誘導三個方向，這些機制并非相互排斥，通過單一或共同作用達到防病效果[22]。同時生防微生物能否成為較好防治棉花黃萎病的微生物菌劑的有效成分，除拮抗微生物具有較好的防病機制外，更重要的是要有對土壤較好的適應性[6]。還有研究指出，土壤水分的流動會影響拮抗細菌的分布，土壤水分的差異會影響拮抗細菌在土壤中的存活[23]。本研究表明土壤含水率、土壤肥力和土壤類型對供試的4株棉花黃萎病拮抗細菌在土壤中的存活能力影響顯著，且顯著影響其對棉花黃萎病的效果，說明拮抗細菌要充分發揮防病作用，對土壤類型、含水率、肥力具有選擇性。這與前人研究結果一致，也為如何高效使用拮抗細菌提供的理論指導。本研究還發現SHZ-24和BHZ-29菌株在土壤中存活率較大且其防病效果較好，而李雪艷[14]指出SMT-24菌株抑菌效果最好，其次為BHZ-29菌株，SHT-15與SHZ-24較差。表明盡管SMT-24抑菌效果較好，但其在土壤中的存活能力較差，進而導致其防病效果并非最優。這一點正好驗證了拮抗細菌在土壤中的存活能力是該菌株發揮生防效果的條件之一。與Chinawoeng等[24]的研究結果——具有良好拮抗效果的假單胞菌PCL1391在番茄根際的存活能力是該菌株發揮生防效果的條件之一——相符。有研究指出土壤酶能夠反映土壤質量在時間或各種不同條件下的變化，改變土壤理化性質、肥力狀況等會顯著影響土壤酶的活性[25-27]，進而影響拮抗細菌在土壤中的存活能力及對棉花黃萎病的防病效果。土壤環境復雜多樣，土壤的活菌計數費時、費力，且準確性較低；因此，從土壤酶活性入手，明確生防菌適應土壤環境的機理，進而為改善生防細菌的防病效果提供理論基礎和技術支撐，值得研究。

圖4 不同土壤肥力下4種拮抗細菌防治棉花黃萎病的效果Fig.4 Control effects of the four antagonistic bacterial isolates to cotton Verticillium w ilt under different soil fertilities

圖5 不同土壤類型對4種生防細菌防治棉花黃萎病效果的影響Fig.5 Effects of different soil types on the four biocontrol antagonistic bacterial isolates to control cotton seed ling Verticillium w ilt

圖6 不同土壤含水率對4種生防細菌防治棉花黃萎病的影響Fig.6 Effects of different soil water contents on four antagonistic bacterial isolates to control cotton Verticillium w ilt

本研究探討了土壤理化環境對拮抗細菌存活的影響，可為拮抗細菌菌株的合理使用及其制劑加工工藝研究提供支持。但拮抗細菌菌株的防效與拮抗菌株的使用方法、劑量及使用時間等密切相關，所以這些拮抗細菌的高效使用技術需要進一步研究明確。

4 結論

以4株棉花黃萎病拮抗細菌為研究對象，明確了不同理化因子、土壤含水率、土壤肥力和土壤類型對其存活及防病效果的的影響。SHZ-24和BHZ-29菌株在土壤中活菌相對數量較高，其中SHZ-24在15%的土壤含水率下達到27.74%，BHZ-29菌株在中等肥力、灰漠土中分別達到24.81%和15.24%；在高肥力、土壤含水率小于20%的土壤條件下，4株拮抗細菌對棉花黃萎病的防效較好；BHZ-29防效最高可達87.12%，SMT-24防效最低僅為35.04%。