海島棉新海35花藥發(fā)育及花粉受精的研究

楊靜，馬益贊，王為然，閔玲，寧新民，孔杰*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室，武漢430070；2.新疆農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，烏魯木齊830091）

作為雌雄同株的植物，生長環(huán)境、成花數(shù)量、花芽發(fā)育等都會影響棉花纖維品質(zhì)。花藥的正常發(fā)育作為花粉粒成熟及受精的必備條件，同樣影響棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)。對花藥發(fā)育的研究需從花器官發(fā)育過程的細胞結構[1]及其具體的細胞特征進行探究。自1999年，Sanderszai等[2]以擬南芥為研究對象，對花藥發(fā)育過程進行了詳細的時期劃分后，人們研究其他開花植物花發(fā)育過程時，均以擬南芥花藥內(nèi)部細胞組成特征作為參照來確定花藥發(fā)育時期。雖然花藥發(fā)育不同時期，環(huán)境條件的改變能夠決定花藥發(fā)育早期細胞的命運，但花藥細胞的特殊結構對花器官的發(fā)育及部分功能的行使具有識別作用[1,3-4]。不同的開花時間、各個花器官對環(huán)境條件的敏感程度[5]、植物本身的部分氧化物及相關基因都會影響開花植物花芽的正常發(fā)育[6]，因此，棉花花芽發(fā)育時期、花蕾大小及其花器官的細胞發(fā)育特征成為研究棉花花發(fā)育的關鍵。其中花藥的發(fā)育過程不僅包括多種細胞形態(tài)建成，也是后期雙受精完成的先決條件。近年，部分學者研究了陸地棉的生育期[7]、花期[8]和高溫脅迫對花藥發(fā)育的影響[9]，而針對花藥發(fā)育過程中細胞結構、相關發(fā)育時期[10]及受精過程的研究并不多見。其中海島棉花蕾發(fā)育與花藥細胞的形態(tài)建成、發(fā)育時期以及花粉的雙受精過程尚未報道。本研究利用半薄切片技術與顯微鏡觀察方法，確定新海35花蕾發(fā)育過程中各發(fā)育時期的細胞特征，建立花發(fā)育時期與花蕾大小的對應關系，同時對花粉萌發(fā)及受精過程進行了探究，以期為海島棉花發(fā)育時期的判定及相關細胞發(fā)育的研究提供參考。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

試驗材料為新海35，由新疆農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所提供。2017—2018年分別種植于新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州庫爾勒市阿瓦提鄉(xiāng)新疆農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所育種家基地（86.08°E，41.68°N）和華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室的棉花溫室。庫爾勒大田白天最低氣溫為16℃，最高氣溫37℃；溫室最低氣溫20℃，最高氣溫36℃，溫室采用花盆單株種植，所用土壤為礫石與基質(zhì)1∶2混合，常規(guī)水肥、防蟲管理。田間管理同常規(guī)大田，定期施肥澆水。根據(jù)長期的監(jiān)測觀察，新海35號從播種到開花為61～67 d，總生育期為135～140 d。

1.2 試驗方法

1.2.1花藥取樣。在花芽發(fā)育早期進行掛牌標記，以便后期對應相同生育期取樣。2017年7月2日和2018年6月15日，分別取大田材料和溫室材料制作切片。從花芽出現(xiàn)開始，待花芽發(fā)育3～6 d后，根據(jù)花蕾發(fā)育長度，每增加1 mm取樣1次，5個重復。取回的花蕾去掉苞葉，用游標卡尺從底端蜜腺處至花蕾頂部進行長度測量、記錄、拍照，并進行解剖觀察。

1.2.2雌蕊柱頭取樣。2018年7月4－8日，在庫爾勒大田每日16:00對發(fā)育正常且長勢一致的新海35號去雄，次日10:00選取即將開放且發(fā)育一致的花蕾對前1 d去雄后留存的雌蕊柱頭進行授粉，隨后套上紙袋，避免其他花粉的污染。人工授粉后0、5、10、20、30、45 m in及1、1.5、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h的雌蕊柱頭取樣；從授粉后30 h開始，之后每隔4 h對授粉的柱頭取1次，即34、38、42 h……74 h。且每次每個時間點采集5個重復，冰盒保濕帶回實驗室用于后續(xù)切片的固定。

1.2.3半薄切片制作、染色及觀察。樣品用FPA固定液（丙酸∶福爾馬林∶70%乙醇＝5∶5∶90，體積比）固定；依次用30%、50%、70%、80%乙醇脫水（體積比）分別脫水15 m in，最后用無水乙醇漂洗1次。用預滲透液（無水乙醇與滲透液1∶1（體積比）混合，1 g的HarderⅠ溶于100 m L Technovit 7100制成滲透液）預滲透12 h，再用滲透液滲透24 h，然后使用包埋液（滲透液∶HarderⅡ＝15∶1，體積比）進行包埋。

切片、展片、染色：將完成后熟的樹脂塊進行切片，厚度5μm。將切好的半薄切片放置在涂有多聚賴氨酸的載玻片上，吸去多余的水，將切好的花藥切片用0.5%甲苯胺藍染色。

封片、拍照：染色完成后，蒸餾水清洗3次，晾干水漬用中性樹膠封片，待樹膠完全干燥后用ZEISSAxioscope A1顯微鏡進行拍照觀察。

2 結果與分析

2.1 海島棉花蕾與花藥發(fā)育形態(tài)變化

海島棉的開花周期較長，從花芽出現(xiàn)至開花一般需要28～30 d。新海35在花芽發(fā)育3～5 d后，花蕾長度為2～3 mm（圖1B）。當花芽發(fā)育6～8 d時，花蕾長度為4～6 mm，此時萼片的發(fā)育早于花瓣，且完全包裹花瓣。花芽發(fā)育14～18 d時，花蕾長度為6～13 mm，花瓣被萼片半包裹。當花芽發(fā)育24～26 d，花蕾長度為14～21 mm，此時被萼片包裹著的花瓣發(fā)育速度明顯加快，且超過了萼片（圖1B）。隨著花蕾繼續(xù)生長，在花芽發(fā)育26～27 d，花蕾長度為21～22mm，此時萼片的發(fā)育速度較為緩慢，花瓣繼續(xù)快速生長體積變大，花瓣顏色由最初的灰白色（1～12 mm）變?yōu)榛揖G色（12～20 mm），而后為淡黃色，快開花時變?yōu)闄幟庶S色（圖1B）。花藥顏色從最初的白色（＜12 mm）逐漸變?yōu)榻瘘S色（圖1B）。花絲和花柱隨著花藥的發(fā)育逐漸伸長，在開花前1天花瓣、花絲、柱頭和花藥生長迅速。在開花當天，花藥開裂，花絲快速伸長（圖1C-E），伸長的花絲在花藥開裂后將成熟的花粉粒散落至柱頭（圖1E），花粉開始萌發(fā)，花粉管伸長，并進行雙受精過程。開花后1～2 d花柱不再伸長，此時花粉受精過程完成（圖1F），卵細胞“休眠”。合子時期，花瓣則變?yōu)殚偌t色（圖1F），花藥開始失水（圖1G），至此海島棉花蕾內(nèi)部花器官發(fā)育完成。

圖1 新海35花蕾及雄蕊發(fā)育形態(tài)Fig.1 The development of buds and stamen of G.barbadense Xinhai35

2.2 花蕾大小與花藥的發(fā)育時期的關系

2.2.1花原基與雄蕊原基時期。棉花的花芽分化需要經(jīng)過花原基分化、苞片分化、花萼分化、花瓣分化、雄蕊分化、雌蕊分化、藥隔形成、花粉母細胞形成、減數(shù)分裂、花粉粒形成等過程。當花芽出現(xiàn)2～3 d可以觀察到長2～3 mm的三角形苞片；花蕾發(fā)育至0.5 mm左右時，苞片生長較快，且苞片迅速增大，其生長速度明顯快于萼片。當萼片在顯微鏡下明顯可見時，萼片上部邊緣形成的突起即花瓣（圖2A），此時花瓣的頂部生長較底部迅速，且在其上部的左右兩端有可見的突起（圖2A）。當花芽出現(xiàn)3～4 d，花蕾長度0.5～1 mm時，雄蕊原基已經(jīng)出現(xiàn)（圖2B）。此時萼片生長速度比花瓣快，且萼片體積增大后包裹著其它正在發(fā)育的花器官。隨著發(fā)育的進程，花瓣向左右相互交錯覆蓋，包裹著隆起的分生組織，而分生組織內(nèi)緣上部形成的突起即雄蕊原基（圖2B）。隨著花芽發(fā)育，雄蕊上形成的突起逐漸彎向中央（圖2B）。雄蕊繼續(xù)向上生長，中央部分分化出雌蕊原基（圖2C）。

2.2.2花藥孢原細胞與花藥四分體時期。新海35花芽出現(xiàn)3～5 d，花蕾長度為2～3 mm，此時經(jīng)由雄蕊原基中間層即L2層細胞分化的孢原細胞已清晰可見（圖2D）。待花芽出現(xiàn)4～6 d，花蕾長至3～4 mm時，孢原細胞經(jīng)平周分裂形成周緣細胞與造孢細胞（圖2E）。花芽出現(xiàn)5～7 d，花蕾長至4～5 mm，此時次生周緣細胞分化出花藥的中間層和絨氈層，內(nèi)皮層出現(xiàn)，裂口組織與維管組織形成，裂口區(qū)域和連接區(qū)清晰可見（圖2F）。花芽出現(xiàn)7～9 d花蕾長至5～6 mm時，經(jīng)花藥原基分化的花粉母細胞和4層花藥壁形成，花粉母細胞結構清晰，4層花藥壁從外到內(nèi)依次為：表皮層、藥室內(nèi)壁、中間層和絨氈層。此時花藥被藥隔分隔為4個藥室，花藥形態(tài)呈清晰的蝴蝶狀（圖2G）。當花芽出現(xiàn)10～12 d時，花蕾生長至6～7 mm，花粉母細胞開始進行減數(shù)分裂（圖2H），花藥中含有貯藏物質(zhì)的一層細胞開始減少，隨后細胞逐漸趨于扁平，直至發(fā)生解體。花芽出現(xiàn)12～13 d花蕾生長至7～8 mm時，花粉母細胞進入減數(shù)分裂后期。隨著花粉母細胞的逐漸成熟，可見被胼胝質(zhì)包裹、含有單倍體小孢子的四分體形成（圖2I）。當花芽出現(xiàn)13～14 d，花蕾生長至8～9 mm時，胼胝質(zhì)降解，小孢子從花粉母細胞的四分體中釋放出來，形成成熟的小孢子，至此小孢子的整個發(fā)育階段完成（圖2J）。

圖2 新海35花蕾長度與花藥發(fā)育時期的對應關系Fig.2 The relationship between buds length and anther development stages of Xinhai35

圖2 （續(xù)）Fig.2 Continued

2.2.3花藥絨氈層發(fā)育時期。絨氈層作為種子植物花藥幼時最內(nèi)側的細胞層，能夠為小孢子的發(fā)育與外壁形成提供蛋白質(zhì)和碳水化合物等營養(yǎng)及原料，合成并分泌胼胝體酶、識別蛋白和孢粉素。當新海35的花芽出現(xiàn)5～7 d，花蕾發(fā)育至4～5 mm時，次生周緣細胞分化出絨氈層（圖2F），花芽出現(xiàn)7～9 d，花蕾為5～6 mm時，絨氈層完全形成（圖2G）。在花芽出現(xiàn)12～13 d，花蕾為7～8 mm時，絨氈層細胞出現(xiàn)液泡化，中層細胞受到擠壓，細胞質(zhì)濃度增加，細胞核體積增大，胼胝質(zhì)積累，中層細胞開始降解（圖2I）。在花芽出現(xiàn)15～17 d，花蕾長度為8～9 mm時，絨氈層合成并分泌胼胝體酶，溶解胼胝質(zhì)使小孢子從四分體中釋放。花芽發(fā)育18～22 d，花蕾9～11 mm時，來源于絨氈層的孢粉素填充在小孢子的初生外壁，小孢子體積增大，花藥膨脹生長。花蕾發(fā)育24～25 d，花蕾14～24 mm時，孢粉素積累，使花藥壁增厚，單核花粉粒經(jīng)非均等有絲分裂形成雙核花粉粒（圖2M-N），此時絨氈層完全降解。

2.2.4花粉粒的形成與釋放。海島棉花芽發(fā)育18～22 d，花蕾長度為9～11 mm時，從四分體釋放出來的小孢子只有1個細胞核，同時具有大液泡。花芽出現(xiàn)22～24 d，花蕾為11～14 mm時，絨氈層逐漸降解從而為小孢子提供營養(yǎng)，同時部分蛋白在小孢子外壁積累（圖2L），形成花粉壁的前體。當花芽發(fā)育24～25 d，花蕾生長至14～24 mm時，小孢子進行有絲分裂，花藥中有豐富的內(nèi)含物，花粉粒開始膨脹生長，可以清晰地觀察花粉粒結構（圖2M）。當花蕾長度大于24 mm時，花粉粒逐漸成熟，隨后裂口組織開始降解，待花粉粒完全成熟，花藥開裂，花粉粒沿裂口區(qū)域沖出藥室，開始散粉（圖2N-O）。

2.3 花粉萌發(fā)與受精

圖3 新海35花粉萌發(fā)與花粉管伸長過程Fig.3 Pollen germ ination and pollen tube elongation of Xinhai 35

2.3.1花粉粒萌發(fā)與花粉管伸長。海島棉花藥正常開裂后，花粉散出，通過人工授粉將花粉涂抹于去雄的柱頭，一定時間后取柱頭，制作切片進行觀察。經(jīng)過0.5～1 h，花粉粒開始萌發(fā)，可清晰地觀察到花粉管伸出（圖3 C），并沿花柱的引導組織逐漸向下呈不規(guī)則的曲線形生長（圖3E-G）。大約在授粉后8 h，可以清晰看到花粉管中攜帶的生殖細胞發(fā)生分裂，形成前后排列的2個子細胞（圖3E）。授粉后12～14 h，花粉管伸長至花柱末端，并進入子房（圖3H）。授粉后16～20 h，花粉管已伸長到達胚珠的珠孔，并通過珠孔進入珠心（圖3H）。授粉后20～24 h，花粉管進一步到達胚囊處，并釋放出營養(yǎng)細胞和生殖細胞等內(nèi)容物（圖3 I-J）。

2.3.2雙受精過程。當人工授粉24 h后，顯微鏡觀察胚囊中清晰可見1枚精子正在與卵細胞進行受精（圖4A）；另1個精子則先靠近1個極核并與之結合（圖4B），隨后與另1極核融合形成受精極核（圖4C-E），至此雙受精完成。雙受精后可以在胚囊內(nèi)清晰看見1個合子和1個助細胞（圖4E）。

2.3.3胚乳發(fā)育。海島棉的柱頭授粉后50 h，觀察到含2個游離核的胚乳（圖4D）；授粉后74 h，可看見已經(jīng)形成了較多的游離核分布在胚囊內(nèi)（圖4F）。與此同時，受精卵結束休眠，胚乳進行第1次分裂。其主要特點是：基細胞大于頂細胞，基細胞靠近珠孔，細胞相對較大；而頂細胞遠離珠孔，細胞相對比較小（圖4G）。此時纖維伸長也比較明顯（圖4H）。

3 討論

3.1 棉花生長周期與花蕾形態(tài)

花器官的形態(tài)建成在植物發(fā)育過程中扮演著重要的作用，其表型不僅指示環(huán)境條件的改變，而且關系植株的生殖發(fā)育。本研究中海島棉新海35從播種到開花需要61～67 d，從現(xiàn)蕾到開花需要28～32 d，從播種到吐絮的總生育期為135～140 d。而陸地棉從現(xiàn)蕾到開花一般僅需要25～30 d[11]。從播種到吐絮的生長周期也比海島棉明顯短4～8 d[7]，有研究認為，這與種質(zhì)相關基因及其棉酚含量有關[12]。新海35花蕾、萼片、花瓣和雄蕊在開花前5 d快速生長，與陸地棉的研究結果相似[13]。隨發(fā)育進程，新海35的花蕾、萼片、花瓣和雄蕊、花藥顏色隨之改變（圖1B-D），且花瓣和花藥顏色變化比陸地棉更為明顯[14]。這可能與次生代謝過程中花青素、類黃酮和花色素等相關物質(zhì)的積累有關[15]。海島棉生殖發(fā)育過程中，光合作用產(chǎn)生的干物質(zhì)以及氮素等營養(yǎng)物質(zhì)均用于生殖生長前期，導致后期積累較少，不能滿足快速發(fā)育需要，所以生育期較陸地棉長[16]。除此之外，海島棉對光照時間、光照強度及溫度有著嚴苛的要求，管理措施不當會導致開花與結鈴時期延后[17]。因此，海島棉新海35的生長周期、花蕾和花藥顏色、發(fā)育表型變化是對自然環(huán)境條件的響應，也是種質(zhì)資源、不同地理來源和遺傳變異共同作用所產(chǎn)生的結果[8,14]。

3.2 棉花花蕾大小與花藥發(fā)育時期

棉花現(xiàn)蕾后，花藥的發(fā)育需經(jīng)歷雄蕊原基突起、孢原細胞分化、1次平周分裂形成造孢細胞，再經(jīng)有絲分裂形成花粉母細胞。花粉母細胞進行減數(shù)分裂形成小孢子，小孢子形成成熟花粉粒[18-19]。海島棉H276保持系花蕾長度3～4 mm時，為花粉母細胞時期；花蕾4～5 mm時為四分體時期；花蕾長度5～6 mm為小孢子單核早期，絨氈層開始退化；花蕾6～7 mm時絨氈層完全降解，部分小孢子已經(jīng)發(fā)育成為成熟的花粉粒。花蕾＞7 mm時形成成熟花粉粒[20]。而陸地棉四分體時期花蕾長度為4.1～5.5 mm，單核時期花蕾縱徑5.6～6.0 mm，成熟的花粉粒時期花蕾縱徑為8.1～10.0 mm[21]。其它研究發(fā)現(xiàn)，在棉花開花期，造孢細胞時期花蕾＜3.5 mm，花粉母細胞時期花蕾為3.5～5.0 mm，花粉粒時期花蕾＞5 mm[22]。本研究中新海35花蕾長度至5～6 mm、7～8 mm、8～9 mm和11～14 mm分別對應花藥發(fā)育中的花粉母細胞形成期、四分體時期、小孢子釋放期和絨氈層降解時期，均比相同發(fā)育時期陸地棉的花蕾長。可能是為海島棉生殖發(fā)育后期積累營養(yǎng)物質(zhì)的要求[16]。

3.3 棉花花粉粒的發(fā)育

花粉粒的成熟是雄蕊發(fā)育的關鍵，只有花粉粒正常發(fā)育，才能保證植株的受精和結實。在雄蕊原基中初生造孢細胞分化形成花粉母細胞[23]。次生周緣細胞分化形成包裹著花粉母細胞的三層同心圓花藥壁[24]，再經(jīng)對稱分裂形成中間層與絨氈層。當小孢子形成時，絨氈層細胞為其提供所需營養(yǎng)物質(zhì)，并將一些遺傳物質(zhì)傳遞給小孢子[25]。小孢子的發(fā)育會直接影響花粉粒的成熟。棉花蕾期花粉粒的發(fā)育受影響會導致花粉敗育。研究證實，陸地棉花蕾處于開花前15～16 d為四分體時期至小孢子發(fā)育早期，開花前9～11 d為單核晚期至雙核早期的發(fā)育階段[26]。而新海35花芽出現(xiàn)10～13 d，花蕾生長至6～7 mm和7～8 mm時分別為花粉母細胞減數(shù)分裂和四分體時期，該時期花蕾的花藥細胞最易受非生物脅迫影響。本研究發(fā)現(xiàn)，海島棉新海35在花蕾為8～9 mm時，小孢子從四分體胼胝質(zhì)中釋放出來。當花蕾11～14 mm時，絨氈層開始降解，為小孢子的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，而細胞殘余及脂類物質(zhì)等覆蓋在小孢子表面形成花粉包被[27]。陸地棉花蕾9～14 mm時，合成并分泌孢粉素，為花粉發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)[28]，而海島棉新海35則在花蕾11～14 mm完成這一過程。新海35絨氈層降解起始時的花蕾比陸地棉1355B稍大[10]，可能是由于溫度、光照及種質(zhì)資源的相關調(diào)控基因改變了絨氈層細胞程序性死亡的時間[29]。因此，海島棉花蕾長度5～6 mm和7～8 mm對應花粉母細胞和四分體時期的正常發(fā)育，在花蕾8～9 mm和11～14 mm時絨氈層能否進行正常降解關系著花粉粒成熟和花藥的正常開裂[30]。

3.4 棉花花粉萌發(fā)及受精過程

在陸地棉中雙受精是精卵融合以及與極核的融合。其中，極核融合的機制是：外膜在多個點上的直接融合，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的融合；隨后是內(nèi)核膜的融合形成橋，隨后橋擴大并愈合，逆向釋放被網(wǎng)羅的細胞質(zhì)成分，最后形成新的完整的核膜，完成核的融合[16]。精卵細胞的融合與極核的融合方式基本一致[25]。本研究中，海島棉花粉粒在柱頭上經(jīng)過0.5～1 h后開始萌發(fā)，花粉管開始生長。授粉后8 h，可以清晰看到花粉管中攜帶的生殖細胞發(fā)生分裂。授粉后20～24 h，花粉管到達胚囊。授粉后24 h，精子與卵細胞進行受精。授粉50 h后，形成游離胚。74 h，胚乳進行第一次分裂，此時纖維明顯伸長。有研究發(fā)現(xiàn)，授粉后12 h和24 h觀察到的花粉管數(shù)量基本一致，且30℃最適于花粉管萌發(fā),花柱中花粉管的平均數(shù)量最多[31]。研究發(fā)現(xiàn)，花粉萌發(fā)率可作為響應溫度的主要指標[32]。在30℃培養(yǎng)條件下花粉萌發(fā)率最高，25℃培養(yǎng)條件下的花粉管長度最長。不同溫度條件不同材料的花粉萌發(fā)率和花粉管長度不同。同時花粉萌發(fā)率和花粉管長度也反映了單株鈴數(shù)和成鈴率[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，授粉后15 h花粉管通過珠孔進入胚囊，釋放內(nèi)含物。48 h后可見胚的分裂。72 h后可以明顯觀察到分裂的早期胚[34]。但在新海35中授粉50 h后，才觀察到纖維發(fā)育，這可能是因為海島棉的受精過程中，極核的受精是精子先與1個極核結合，然后再與另1個極核進行核膜、核質(zhì)的融合，因此所需要受精時間較長。這也證實了海島棉的受精時間比陸地棉長[25]。雙受精完成之后，棉花纖維進入伸長期，與此同時纖維細胞出現(xiàn)大液泡[35]。這一時期是遺傳物質(zhì)傳遞的關鍵時期，環(huán)境條件及相關基因的作用都會影響海島棉受精時間。

4 結論

海島棉新海35花藥顏色和花藥細胞隨著花蕾發(fā)育呈現(xiàn)動態(tài)變化。在相同的花藥細胞發(fā)育階段，新海35的花蕾比陸地棉的花蕾更長，且各發(fā)育階段所需的時間更長。結合花芽發(fā)育時間、花蕾形態(tài)學及細胞學觀察，確定了新海35花粉母細胞形成期、四分體時期、小孢子釋放期和絨氈層降解時期花蕾長度分別為5～6 mm、7～8 mm、8～9 mm和11～14 mm階段。同時新海35授粉后，花粉粒萌發(fā)需要0.5～1 h，花粉管延伸到子房需要12～14 h，而受精過程則是在授粉后24 h完成，而授粉后50～74 h胚乳開始發(fā)育并伴隨著纖維的發(fā)育。