失巢環境下腫瘤源性外泌體調控結腸癌細胞的增殖和凋亡相關機制研究

金霞云 柴華 朱忠權 李曉飛 藍志堅

1 材料和方法

1.1 材料 結腸癌細胞系SW480由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所惠贈。改良 Eagle培養基（DMEM）培養液（批號：10829018，500 ml）購自美國 Gibco公司；Trizol試劑（批號：10296028，100 ml）和熒光定量 PCR試劑盒（批號：KK4611，10 ml）均購自日本 TaKaRa公司；CCK-8試劑盒（批號：AC11L113，1ml）、Edu試劑盒（批號：KTA2031，500T）和 AVPI檢測試劑盒（批號:40302ES20，200T）均購自北京碧云天試劑公司。細胞外信號調節激酶5（ERK5）抗體（批號：ab196609，100 μl）、凋亡相關因子 B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）（批號：ab117115，100 μl）、B淋巴細胞瘤-2基因相關啟動子（Bad）（批號：ab90435，100 μl）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）（批號：ab13847，50 μl）均購自美國 Abcam 公司。polyHEMA試劑（批號：P3932，10G）購自瑞禧生物有限公司。

1.2 結腸癌抗失巢凋亡細胞株的獲取 采用95%乙醇溶液配置濃度為10 mg/ml的polyHEMA試劑。37℃水浴箱預熱處理，充分溶解polyHEMA試劑，然后將工作液均勻鋪在細胞培養板表面，形成表面的包被膜，然后置于65℃烤箱烘干。利用紫外線燈進行消毒處理以備用。待結腸癌細胞的融合率達80%時，利用EDTA胰蛋白酶收集細胞，制備細胞懸液。按照1×105個/ml的細胞量接種于低黏附六孔板中，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中，培養3 d后收集懸浮的結腸癌細胞，5 000 r/min，離心5 min，棄上清液，加入PBS溶液，制備單細胞懸液。按照1×105個/ml的細胞量接種于低黏附六孔板中，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中進行培養。如此反復培養7次后，最終獲得結腸癌的抗失巢凋亡細胞株。于懸浮培養12 h和24 h后利用顯微鏡下觀察抗失巢凋亡細胞株。

1.3 細胞凝集能力檢測 選取常規結腸癌細胞和抗失巢凋亡細胞株制備細胞懸液，按照1×105個/ml接種于低黏附六孔板中，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中，6 h后利用光學顯微鏡觀察細胞的凝集團細胞數量，計算凝集率，凝集率=視野下凝集細胞數/（視野下凝集細胞+單個細胞）×100%。

1.4 外泌體的提取 采用超速離心法收集抗失巢凋亡細胞和常規結腸癌細胞的外泌體。將抗失巢凋亡細胞和常規結腸癌細胞處理24 h后，棄上清液，利用PBS溶液清洗3次，更換無FBS的DMEM培養基，孵育48 h，收集細胞上清液，4℃、300 r/min，離心10 min，棄掉細胞碎片，收集上清液后再次離心，4℃、2000r/min，離心20 min，取上清液棄沉淀，重懸后經0.22 μm濾器過濾，轉移至超速離心管中，4℃、10 000 r/min，離心70 min，取沉淀。PBS沖洗沉淀物，4 ℃、10 000 r/min，離心 70 min，重復3次，將得到的外泌體懸液于-80℃冰箱中保存。

1.5 透射電鏡觀察外泌體形態 取30 μl外泌體懸液，放置于栽樣銅網上，室溫下靜置3 min，加入3%磷鎢酸溶液30 μl，室溫下負染 5 min，室溫下孵育直至銅網干燥，然后透射電鏡觀察外泌體形態。

1.6 外泌體標志物CD63和CD81表達的檢測 采用Western blot法。將100 μl外泌體置于EP管中，利用1 ml PBS溶液進行稀釋，冰上預冷10 s，加入RIPA裂解液后，提取總蛋白，利用BCA試劑盒確定蛋白濃度。按照SDS-PAGE說明書要求配置10%分離膠和5%濃縮膠，加入分離膠后加入分子梳。取30 μg蛋白質上樣，先使用80 V電壓進行電泳，待條帶跑至濃縮膠和分離膠的交接點后，改為120 V電壓。待條帶跑至分離膠底部，停止電泳。利用PVDF膜和濾紙進行轉膜，設置轉膜電流為200 mA，轉膜槽放至冰袋中低溫處理。轉膜成功后浸入封閉液中，搖床封閉2 h，加入CD63和CD81一抗稀釋液（1:10 000），4℃ 孵育過夜，TBST溶液清洗3次，5 min/次，加入稀釋好的 HRP二抗溶液（1:2 000），孵育二抗，TBST溶液清洗3次，5 min/次，加入Supersignal west femto試劑盒顯影液，分光發光成像分析儀顯影，出現蛋白條帶則為陽性。

1.7 結腸癌細胞攝取及內化外泌體 將超速離心法提取的外泌體沉淀與1 ml的PBS溶液混合，利用超聲攪拌器重懸后保存。將4 μl的PKH67加入0.5 ml混懸液中，在室溫下孵育10 min。然后加入1 ml的10%BSA溶液，利用PBS溶液清洗3次，5 min/次。然后利用超速離心法收集PKH67標記的外泌體以備用。將結腸癌細胞接種于預先鋪有蓋玻片的24孔板中，接種細胞量為3×105個/孔，待爬片細胞融合率＞60%時，利用PBS溶液清洗3次，5 min/次。然后加入0.5 ml PKH67標記的外泌體混懸液，放置在37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養24 h，再采用4%多聚甲醛溶液固定30 min，加入紅色CY3染液進行細胞染色，避光孵育20 min后利用PBS溶液清洗3次，5 min/次。再利用10 μg/ml的DAPI染液進行染色，避光孵育15 min。利用PBS溶液清洗3次，5 min/次。利用指甲油封片，加入防淬滅劑。利用熒光顯微鏡進行觀察。

包容性：中原文化具有兼容眾善、合而成體的特點。中原文化通過經濟、戰爭、宗教、人口遷徙等眾多方式，實現了物質文化、制度文化和思想觀念的全面融合與不斷升華。鄭州大河村遺址中出土的一些富有山東大汶口文化特征的陶器，說明中原文化在那時就開始吸收周邊文化成果，熔鑄到自己的文化之中。胡服、胡樂、胡舞、胡食在漢唐間傳入中原，也都被吸收到中原文化之中。

1.8 細胞行為學檢測

1.8.1 細胞增殖率檢測 采用CCK-8法。將100 μl的外泌體懸液分別加入常規結腸癌細胞和抗失巢凋亡結腸癌細胞中，在同一培養瓶中進行共培養，待細胞融合率＞50%后，將上述兩組細胞接種于96孔板中，100 μl/孔，在37℃、5% CO2的培養箱中培養5 h，然后每孔加入100 μl CCK-8試劑，37℃培養箱中孵育10 min，酶標儀測定在450 nm處的吸光度（OD值）。檢測處理4、8、12、24 h后各組細胞的增殖率，細胞增殖率=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%（As為實驗孔 OD 值，Ac為對照孔 OD值，Ab為空白孔OD值）。

1.8.2 細胞增殖檢測 采用EdU法。外泌體與結腸癌細胞共培養后，接種于預先鋪有玻璃片的96孔板中，100 μl/孔，在 37 ℃、5% CO2的培養箱中培養 24 h 后，加入50 μM的EdU試劑。避光孵育24 h后利用PBS溶液進行清洗3次，5 min/次。加入100 μl的4%多聚甲醛溶液，室溫條件下孵育30 min，利用PBS溶液進行清洗，5 min/次。加入 100 μl的 0.5% TritonX-100，用于對細胞膜的滲透。用PBS溶液清洗3次，5 min/次。加入100 μl的20%DAPI染液進行核染處理。熒光顯微鏡下進行觀察細胞增殖情況，計算細胞增殖率，細胞增殖率=視野下Edu染色陽性/視野下DAPI染色陽性×100%。

1.8.3 細胞凋亡檢測 采用雙染法細胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV FITC-PI，AV-PI）檢測細胞凋亡。外泌體與結腸癌細胞共培養后，利用EDTA蛋白酶收集各組細胞，預冷PBS溶液清洗3次，5 min/次，300 r/min離心后取細胞沉淀，加入100 μl Bingding buffer進行重置，然后根據AV-PI試劑盒說明書要求加入5 μl Annexin VFITC和10 μl PI染液。避光孵育30 min后，利用流式細胞儀進行檢測細胞凋亡，結果包括四個象限：Q1：壞死細胞區；Q2：晚期凋亡細胞區；Q3：早期凋亡細胞區；Q4：活細胞區。細胞凋亡率=早期凋亡+晚期凋亡（Q2+Q3）。

1.8.4 ERK5和凋亡相關基因Bcl-2、Bad和Caspase-3 mRNA表達的檢測 采用RT-PCR。外泌體與結腸癌細胞共培養后，利用胰蛋白酶收集上述各組細胞，經PBS溶液清洗3次，5 min/次，常溫離心機1 500 r/min離心5 min，取沉淀，加入1 ml Trizol溶劑，提取細胞總RNA，保證RNA純度范圍為1.8～2.1，然后利用逆轉錄試劑盒的要求，采用20 μl反應體系逆轉錄為cDNA，-80℃保存，采用RT-PCR試劑盒的要求，采用FTC-2000 RTPCR系統和50 μg反應體系對樣本DNA進行分析，溶解曲線確定Tm值為53.7℃，統計并記錄各組樣本的CT 值，采用 2-ΔΔCt法對 ERK5 和凋亡相關基因 Bcl-2、Bad、Caspase-3 mRNA的表達水平進行統計。引物設計由上海生工公司設計，見表1。

表1 ERK5和凋亡相關基因Bcl-2、Bad、Caspase-3的引物序列

1.8.5 ERK5和凋亡相關因子Bcl-2、Bad和Caspase-3蛋白表達的檢測 采用Western blot法。外泌體與結腸癌細胞共培養后，收集各組細胞，加入1 ml RIPA細胞裂解液，各組細胞在冰上裂解30 min，收集入1.5 ml的離心管中，在預冷4℃的離心機中離心，預設：5 000 r/min，5 min后提取上清液，經95℃煮沸后，收集蛋白備用。按照說明書制備濃縮膠10 ml，分離膠20 ml。上樣后電泳分離，轉膜后在4℃冰箱避光孵育過夜（＞12 h）。ERK5和Bcl-2、Bad、Caspase-3一抗經一抗稀釋液1:5 000稀釋后加入樣本離子膜。第2天用PBST稀釋液洗膜，重復3次，加用山羊抗小鼠IgG二抗經二抗稀釋液1:1 000稀釋后孵育二抗1.5 h，用PBST稀釋液洗膜，重復3次，而后用DAB顯影液處理樣本。采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值進行蛋白表達水平的統計和分析。

1.9 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 失巢環境下結腸癌細胞的培養結果 結果顯示，利用懸浮細胞培養法可以培養失巢環境下的抗失巢凋亡細胞，并且隨著培養時間的延長，可見細胞凝集成團。見圖1（插頁）。

圖1 失巢環境下結腸癌細胞的培養結果（a：貼壁培養中的結腸癌細胞；b：懸浮培養12 h后結腸癌細胞；c：懸浮培養24 h后結腸癌細胞）

2.2 兩組細胞凝集能力的比較 結果顯示，抗失巢凋亡結腸癌細胞組細胞凝集率為（68.15±4.89）%，常規結腸癌細胞組為（23.21±3.46）%，抗失巢凋亡結腸癌細胞組細胞凝集能力要明顯高于常規結腸癌細胞，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 2（插頁）。

圖2 抗失巢凋亡細胞的凝集能力檢測（a：常規結腸癌細胞組的凝集率檢測；b：抗失常凋亡結腸癌細胞組的凝集率檢測）

2.3 失巢環境培養下結腸癌細胞的外泌體鑒定結果 結果顯示，外泌體為直徑50～150 nm的雙層膜囊泡狀結構。Western blot結果顯示，外泌體的分子標志物CD63和CD81表達陽性。見圖3。

圖3 失巢環境培養下結腸癌細胞外泌體鑒定結果（a：電子顯微鏡下常規結腸癌細胞來源外泌體和抗失巢凋亡結腸癌細胞來源外泌體的形態，×800；b：常規結腸癌細胞來源外泌體和抗失巢凋亡結腸癌細胞來源外泌體中CD63和CD81的表達）

2.4 結腸癌細胞攝取及內化PKH67標記的外泌體鑒定結果 結果顯示，失巢環境下提取的外泌體與結腸癌細胞共培養的過程中，可見結腸癌細胞可以攝取并內化PKH67標記的外泌體。見圖4（插頁）。

圖4 結腸癌細胞攝取及內化PKH67標記的外泌體鑒定結果（a：結腸癌細胞染色；b：綠色PKH67標記的外泌體；c：合并圖層）

2.5 兩組細胞增殖率的比較 結果顯示，處理4、8、12、24 h后，抗失巢凋亡結腸癌細胞來源外泌體與結腸癌細胞共培養后細胞的增殖率明顯高于常規結腸癌細胞組（均 P＜0.05），見表 2。

表2 兩組細胞增殖率的比較（%）

2.6 兩組細胞增殖能力的比較 結果顯示，抗失巢凋亡結腸癌細胞外泌體與結腸癌細胞共培養后細胞的增殖能力[（23.76±2.57）%]明顯高于常規結腸癌細胞組[（9.04±0.32）%]（P＜0.05），見圖5（插頁）。

圖5 Edu染色結果（a：常規結腸癌細胞組細胞的DAPI染色，Edu染色和合并圖層；b：抗失巢凋亡結腸癌細胞組細胞的DAPI染色，Edu染色和合并圖層）

2.7 兩組細胞凋亡率的比較 結果顯示，抗失巢凋亡結腸癌細胞組的凋亡率為（0.080±0.030）%，常規結腸癌細胞組的凋亡率為（0.253±0.121）%，抗失巢凋亡結腸癌細胞組細胞凋亡率明顯低于常規結腸癌細胞組，差異有統計學意義（t=2.891，P＜0.05），見圖 6（插頁）。

圖6 AV-PI試劑盒檢測結果（a：常規結腸癌細胞組的細胞凋亡率；b：抗失巢凋亡結腸癌細胞組的細胞凋亡率）

2.8 兩組細胞ERK5和凋亡相關基因Bcl-2、Bad和Caspase-3的mRNA相對表達水平的比較 結果顯示，抗失巢凋亡結腸癌細胞組的ERK5、Bad和Caspase-3的mRNA相對表達水平要明顯低于常規結腸癌細胞組（均P＜0.05），而抗凋亡因子Bcl-2高于常規結腸癌細胞組（P＜0.05），見表 3。2.9 兩組細胞ERK5和凋亡相關基因Bcl-2、Bad和Caspase-3的蛋白表達水平的比較 結果顯示，抗失巢凋亡結腸癌細胞組的ERK5、Bad和Caspase-3的蛋白表達水平要明顯低于常規結腸癌細胞組（均P＜0.05），而抗凋亡因子Bcl-2高于常規結腸癌細胞組（P＜0.05），見表4。

表3 兩組細胞ERK5和凋亡相關基因Bcl-2、Bad和Caspase-3的mRNA相對表達水平的比較

表4 兩組細胞ERK5和凋亡相關基因Bcl-2、Bad和Caspase-3的蛋白相對表達量的比較（灰度值）

3 討論

腫瘤的復發與多種因素密切相關，比如癌基因和抑癌基因的突變，細胞外基質的降解和免疫因素等[6-7]。但是，在腫瘤復發的過程中，腫瘤細胞會脫離原來的基質環境，失去基質黏附，處于失巢環境中，從而造成“失巢凋亡”[8-9]。既往研究表明，失巢環境中細胞凋亡率明顯改變，姜黃素、藤梨根等對于結腸癌的干預作用正是通過干預其失巢環境來調控結腸癌的復發與耐藥性[10-11]。外泌體是一類雙層脂質結構的囊泡結構，可以由細胞分泌，攜帶大量的遺傳物質，包括miRNA、lincRNA和各類基因等，通過膜融合和胞吞的方式，將遺傳信息傳遞至受體細胞中，從而影響受體細胞的生物學行為[12-13]。有研究表明，腫瘤細胞和基底細胞之間可以通過外泌體進行遺傳信息的交換[14]。因此，本研究主要目的是探究失巢環境來源的外泌體對結腸癌細胞生物學行為的影響，以期為結腸癌的臨床治療提供新的思路和靶點。

腫瘤微環境與腫瘤細胞的生物功能密切相關，腫瘤微環境的變化可以影響腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲等。隨著對腫瘤的進一步研究，腫瘤所處的微環境也逐漸引起學者的關注[15-16]。腫瘤的復發與腫瘤微環境密切相關，包括基質降解、腫瘤細胞游走和腫瘤細胞再黏附。而在基質降解、細胞游走的過程中，貼壁細胞會轉變為懸浮細胞，造成“失巢”的微環境[17]。有研究表明，在失巢環境下，腫瘤細胞會發生聚集，并且對細胞凋亡的程序性啟動產生一定的抵抗能力，叫做“抗失巢凋亡”[18]。直至細胞游走到新的附著環境中，然后重新附著后造成腫瘤的復發和轉移[19]。本研究證明，利用95%乙醇溶液配置濃度為10 mg/ml的polyHEMA試劑，形成表面的包被膜，構建“失巢環境”，得到抗失巢凋亡細胞系。利用細胞凝集率檢測細胞的凝集能力，結果表明，抗失巢凋亡結腸癌細胞的細胞凝集能力明顯高于常規結腸癌細胞。與之前的研究結果相同。

外泌體是目前研究的熱點問題，細胞與細胞之間、細胞與環境之間的交流可以通過外泌體攜帶相關的信號分子來實現。有研究表明，外泌體可以在細胞和微環境之間構建一條“橋梁”，可以將微環境中的相關信息通過外泌體傳遞到細胞內，也可以將細胞內的遺傳信號通過外泌體傳遞到細胞周圍微環境中，從而實現細胞與周圍微環境的信號交流[20]。本研究結果顯示，失巢環境下提取的外泌體與結腸癌細胞共培養的過程中，可見結腸癌細胞可以攝取并內化PKH67標記的外泌體，說明結腸癌可以內吞外泌體，從而發揮作用。本研究利用CCK-8試劑盒、Edu試劑盒和AV-PI試劑盒檢測在常規結腸癌細胞外泌體和抗失巢凋亡結腸癌細胞外泌體的刺激下結腸癌細胞的增殖和凋亡能力，結果表明，抗失巢凋亡結腸癌細胞外泌體可以促進結腸癌細胞的增殖，抑制細胞的凋亡。

Bcl-2和Bad與凋亡密切相關的基因，其中，Bad是促凋亡因子，而Bcl-2是抑制凋亡因子。而且，Caspase-3蛋白有“死亡蛋白”的說法，Caspase-3的激活可以促進細胞的凋亡[21-22]。本研究通過RT-PCR和Western blot結果發現，缺氧環境中的外泌體可以從mRNA和蛋白兩個層面上抑制凋亡相關因子Bad和Caspase-3的表達，促進抗凋亡因子Bcl-2的表達，結果說明，抗失巢凋亡結腸癌組外泌體可以抑制細胞的凋亡。本研究還利用AV-PI試劑盒檢測細胞的凋亡率，結果發現，抗失巢凋亡結腸癌組外泌體可以抑制細胞的凋亡。另外，筆者發現，MAPK/ERK5的表達水平在抗失巢凋亡結腸癌組外泌體刺激下，其mRNA表達水平和蛋白表達水平均明顯下降。所以，筆者推測，外泌體對細胞增殖和凋亡的調控是通過ERK5信號通路。既往研究表明，ERK5信號通路可以介導細胞的增殖和凋亡通路，與本研究結果相同。

綜上所述，抗失巢凋亡結腸癌細胞外泌體可以通過ERK5信號通路促進細胞的增殖，抑制細胞的凋亡。