GRIN2A、GRIN2B基因多態(tài)性與注意缺陷多動障礙的關(guān)聯(lián)研究

丁凱景 丁雨欽 周圓月 劉艷 簡鳳清 廖文靜 童海靜 孫玉燕 李艷萍 周國嶺

注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）是一種神經(jīng)發(fā)育障礙，我國兒童青少年的患病率為6.26%[1]。ADHD的核心癥狀為注意力不集中、多動和（或）沖動[2]，對患者教育、工作、生活等多項(xiàng)個(gè)人發(fā)展問題影響深遠(yuǎn)，給家庭、社會造成負(fù)擔(dān)，是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。ADHD的病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明了，許多研究提示ADHD有家族聚集性，大量的家系、寄養(yǎng)子、雙生子及新近分子水平的研究均提示遺傳因素是ADHD的發(fā)病機(jī)制之一[3-4]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)與這種疾病直接相關(guān)的特異性基因，具體的遺傳模式也尚未闡明。谷氨酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的一種氨基酸類興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)系統(tǒng)多種重要功能的調(diào)節(jié)[5]。N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR）是離子型谷氨酸受體的一個(gè)亞型，不僅在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要的生理作用，而且對神經(jīng)元回路的形成亦起著關(guān)鍵的作用，研究表明NMDAR是學(xué)習(xí)和記憶過程中一類至關(guān)重要的受體[6]。本研究選取了NMDAR亞基NMDA2A基因（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A，GRIN2A）和NMDA2B基因（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2B，GRIN2B）的2個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（single nucleotide polymorphisms，SNPs）進(jìn)行研究，探討其基因多態(tài)性與ADHD之間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2016年2月至2018年4月就診于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心（杭州市第七人民醫(yī)院）兒童心理科ADHD患兒49例（ADHD組），其中男36 例、女 13 例，年齡 6～15（8.55±2.88）歲，ADHD 由 2 名主治級別以上的精神科醫(yī)師按照美國精神疾病診斷統(tǒng)計(jì)手冊第五版（the diagnostic and statistical manual of mental disorders fifth edition，DSM-5）為診斷標(biāo)準(zhǔn)共同確診。選擇同時(shí)期我院健康體檢兒童50例作為健康對照組，其中男 30 例，女 20 例，年齡 6～15（8.80±2.49）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）智商＜70分；（2）自閉癥譜系障礙、抽動穢語綜合征及其他神經(jīng)發(fā)育障礙；（3）目前或既往符合精神分裂癥、情緒障礙及其他精神心理疾病；（4）癲癇及其他重大軀體疾病。兩組對象性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究均征得患兒本人知情同意，并由監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 ADHD癥狀評定及神經(jīng)心理測評 采用以下ADHD癥狀評定量表和神經(jīng)心理測評，對患兒進(jìn)行認(rèn)知功能、行為表現(xiàn)、注意力水平的系統(tǒng)評價(jià)。（1）兒童注意力量表（Swanson，Nolan，and Pelham version Ⅳ scale，SNAP-Ⅳ）：采用26條目量表，內(nèi)容包含注意缺陷分量表（第1～9題）、多動沖動分量表（第 10～18題）、對立違抗分量表（第19～26題），由患兒父母填寫，用以評估ADHD患者的嚴(yán)重程度并進(jìn)行亞型分類[7]。（2）中國韋氏兒童智力量表（Chinese Wechsler intelligence scale for children，C-WISC）：由心理測量技師實(shí)施，用以評價(jià)兒童智力水平。（3）Conners父母評癥狀量表（conners parent symptom questionnaire，PSQ）：采用 48 條目量表，包含沖動多動、品行問題、多動指數(shù)、學(xué)習(xí)問題、心身障礙和焦慮6個(gè)因子，由患兒父母填寫，篩查兒童行為問題。（4）注意力競量測驗(yàn)（the test of variables of attention，T.O.V.A.）：其為一種持續(xù)性操作測驗(yàn)，包含理解力商數(shù)、控制力商數(shù)、注意力商數(shù)、多動商數(shù)值等指標(biāo)，用以評價(jià)ADHD患兒的操作水平。

1.2.2 基因檢測 兩組對象均抽取外周靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝管-20℃冰箱保存，抽提樣本DNA（北京天根生化科技有限公司，血液基因組DNA提取試劑盒），采用紫外分光光度法進(jìn)行DNA濃純度測定后保存于-80℃冰箱備用。根據(jù)美國國立生物信息情報(bào)中心檢索dbSNP數(shù)據(jù)庫（datebase of single nuleotide polymorphisms，dbSNP）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）以及既往文獻(xiàn)[8-9]，選取GRIN2A rs2229193和GRIN2B rs2284411作為候選基因位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（GRIN2B基因：5′-ACGTTGGATGATGACATCATCAGTGTCTGC-3′and 5′-ACGTTGGATGCATGACTTTTTTCCCCTACTC-3，GRIN2A基因：5′-ACGTTGGATGTTGACGAACTTCCGACATGG-3′and 5′-ACGTTGGATGCGTCATCGTGGAAGACA TAG-3′）。使用SNP基因分型試劑盒（美國，Applied Biosystems公司，40×TaqManSNP Genotyping Assay Mix）及萬能 PCR液（大連寶生物工程有限公司，Premix Ex TaqTM），在ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（美國，Applied Biosystems公司）上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s、40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，讀取反應(yīng)后的熒光數(shù)據(jù)，利用內(nèi)置軟件進(jìn)行等位基因分型。采用PCR凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并隨機(jī)選取兩個(gè)樣本測序驗(yàn)證多態(tài)性與實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)一致性。

1.2.3 觀察指標(biāo) 比較兩組GRIN2A基因型頻率G/G和G/A，GRIN2B基因型頻率C/C和（T/C+T/T）的分布差異。結(jié)合ADHD癥狀評定量表和神經(jīng)心理測評得分，比較GRIN2A、GRIN2B不同基因型ADHD患兒的癥狀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)合臨床數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)經(jīng)Epidata 3.0軟件二次錄入并核對。采用Haploview軟件進(jìn)行候選基因多態(tài)位點(diǎn)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)和連鎖不平衡分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果 兩組各SNPs基因型頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律（P＞0.05）。樣本有群體代表性，基因頻率能代表群體的基因分布。

2.2 兩組兒童GRIN2A、GRIN2B基因型頻率比較 見表 1、2。

表1 兩組兒童GRIN2A基因型頻率比較

由表1可見，兩組兒童GRIN2A基因型頻率（G/G比較G/A）分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

由表2可見，兩組兒童GRIN2B基因型頻率C/C和（T/C+T/T）分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 兩組兒童GRIN2B基因型頻率比較

2.3 GRIN2A、GRIN2B兩種不同基因型ADHD患兒的癥狀比較 見表3、4。

由表3、4可見，GRIN2A為G/A+A/A基因型的患兒較G/G基因型的患兒有更高的SNAP-Ⅳ對立違抗分量表得分，以及更高的PSQ品行問題得分，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。兩種基因型患兒在SNAP-Ⅳ其他分量表分、C-WISC、PSQ、T.O.V.A.比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。GRIN2B為C/C基因型和T/C+T/T基因型的兩種患兒 SNAP-IV、C-WISC、PSQ、T.O.V.A.比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表3 GRIN2A兩種不同基因型ADHD患兒的癥狀比較（分）

表4 GRIN2B兩種不同基因型ADHD患兒的癥狀比較（分）

3 討論

谷氨酸參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的樹突、軸突結(jié)構(gòu)發(fā)育及參與突觸可塑性的形成等[6]。Spencer等[10]在對50個(gè)應(yīng)用磁共振光譜學(xué)技術(shù)的薈萃分析中發(fā)現(xiàn)，ADHD患兒顱內(nèi)尤其前扣帶皮層中谷氨酸代謝增加。在ADHD大鼠模型中，研究者也發(fā)現(xiàn)，前額葉紋狀體腦組織中發(fā)生谷氨酸代謝水平紊亂[11]。Park等[12]還發(fā)現(xiàn)谷氨酸代謝型受體亞型7（mGluR7）基因（GRM7）rs37952452的G/A基因型相較G/G基因型在哌醋甲酯治療中有更明顯的反應(yīng)速度，可能在兒童多動癥治療響應(yīng)哌甲酯發(fā)揮作用。谷氨酸受體基因在精神疾病中起著重要作用，并且可能與ADHD的癥狀表現(xiàn)或藥物響應(yīng)相關(guān)[13]。

Dorval等[14]對GRIN2B的9個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中3處單核苷酸多態(tài)性（其中以rs2284411尤為顯著）顯示了顯著的傳遞不平衡，且與ADHD的注意力缺陷、沖動多動癥狀均有關(guān)聯(lián)，但與認(rèn)知水平、口頭的短時(shí)記憶或言語工作記憶無關(guān)。Turic等[15]發(fā)現(xiàn)GRIN2A的5號外顯子遺傳變異與ADHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)；然而Adams等[5]卻并未發(fā)現(xiàn)GRIN2A與ADHD沖動控制、認(rèn)知表型的顯著關(guān)聯(lián)；同樣，Nyman等[16]也并未發(fā)現(xiàn)GRIN2A多態(tài)性與ADHD的陽性結(jié)果。高雪屏等[17]應(yīng)用基因掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)GRIN2A的G1430A位點(diǎn)多態(tài)性與ADHD可能并無關(guān)聯(lián)。Kim等[9]發(fā)現(xiàn)ADHD患者GRIN2B等位基因與響應(yīng)時(shí)間變異性存在關(guān)聯(lián)，C/C亞組的響應(yīng)時(shí)間變異性高于C/T+T/T亞組；GRIN2A等位基因的G/G亞組比G/A+A/A亞組在測驗(yàn)中存在更多的遺漏錯(cuò)誤。該課題組的另一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)GRIN2B基因rs2284411位點(diǎn)C/C基因型顯示出對哌醋甲酯更好的治療反應(yīng)，GRIN2B基因C/C基因型在CPT的RTV上也顯示出更大的改善，GRIN2A基因G/G基因型比G/A基因型顯示出更大的CPT錯(cuò)分誤差改善[8]。同時(shí)，kim等[18]團(tuán)隊(duì)的頭顱MRI成像研究也發(fā)現(xiàn)GRIN2B等位基因與左側(cè)上頂葉簇的靜態(tài)區(qū)域同質(zhì)性均值有顯著的診斷和交互作用，且靜態(tài)區(qū)域同質(zhì)性均值與具有T等位基因亞組的多動癥兒童顏色痕跡測試干擾評分呈正相關(guān)。而最近Zhang等[19]的研究則未發(fā)現(xiàn)GRIN2A、GRIN2B基因多態(tài)性與中國漢族人群ADHD易感性顯著相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)GRIN2A基因中A等位基因攜帶患兒有更多的對立違抗行為和品行問題，提示GRIN2A基因多態(tài)性可能與ADHD共病對立違抗障礙及品行障礙相關(guān)。與既往相關(guān)研究結(jié)果的不一致性可能與不同種族人群之間等位基因差異有關(guān)。本研究樣本量較少，且ADHD是多基因遺傳的復(fù)雜疾病，存在多種基因交互作用，本研究局限于兩個(gè)候選基因位點(diǎn)，該結(jié)論需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并行更多的谷氨酸能相關(guān)基因研究驗(yàn)證。