無糖型強力枇杷露的安全性評價研究＊

陳昕昕，邵田莉，黃秋平，張曉潔，蔡溢，諶紅獻**

（1.中南大學湘雅二醫院精神衛生研究所，湖南 長沙 410011；2.深圳市康寧醫院精神科，廣東 深圳 518000）

20世紀90年代，我們曾發現何首烏具有肝毒性作用、馬兜鈴酸成分具有腎毒性作用、麻黃具有神經毒性作用等，可見，對中藥藥物開展安全性評價十分重要。但由于中藥成分復雜，具有用藥起效慢、周期長、體內作用部位廣等特點，導致安全性評價研究開展的難度較大。

強力枇杷露是《衛生部藥品標準中藥成方制劑》中記載的中藥成分藥物制劑[1]，由多種中藥成分及輔料構成，因含有罌粟殼成分而具有較好的止咳效果。罌粟殼是《中國藥典》中記載的麻醉制劑、有毒制劑，也是麻醉藥物中唯一的中藥飲片[2]。罌粟殼中的阿片類藥物成分進入腦血屏障后作用于延髓，能夠抑制咳嗽中樞及咳嗽反射，起到止咳效果[3]。此外，強力枇杷露中添加的防腐劑輔料苯甲酸鈉，如長期過量服用會損傷神經系統[4]，并產生細胞毒性[5]，提高致癌風險[6]。因此，對強力枇杷露進行安全性評價具有重要意義。

半數致死量（Median Lethal Dose，LD50）是指在固定時間內（24～48 h）內予以實驗物質后，能夠引起實驗動物死亡率達到50%的實驗物質的劑量，作為傳統急性經口毒性實驗的常用指標，用于衡量不同藥物的毒性大小和優劣。測量藥物LD50方法有很多，常用的有序貫法（即上下法，Up-and-Down Procedure）和霍恩氏法，還有寇氏法、累積法、回歸法（logistic）等。序貫法包括兩個實驗過程，即限度試驗和主實驗[7]，使用程序或者特殊公式來計算LD50，是國際上進行急性毒性試驗的替代方法[8]，也是我國政府部門檢測化學藥物急性毒性的推薦方法[9]。

目前，國內對強力枇杷露的研究主要集中在成分和質量方面，尚未發現有針對其安全性開展的研究。強力枇杷露中的嗎啡成分，具有一定的依賴性和毒性。嗎啡的毒理作用表現在體內代謝會增加肝臟內的自由基，破壞肝臟組織，使體內的一氧化氮增加[10]。既往研究中，如對老鼠注射3個月嗎啡，會引起雄性老鼠的生殖細胞結構變化及數量減少[11]。嗎啡依賴的小鼠對毒性反應更加敏感，腹腔注射甲基苯丙胺的LD50約為正常小鼠的一半[12]。此外，強力枇杷露中的輔料苯甲酸鈉屬于一種防腐劑，同樣具有細胞毒性[13]。綜合以上情況，研究無糖型強力枇杷露的安全性是有必要的，本文使用序貫法來測量該藥物的LD50，并觀察其毒性作用。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康未孕雌性Sprague Dawley（SD）大鼠[14]、初始體重200±20 g（由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供）。SD大鼠進入實驗室后，置于12 h明暗節律的動物房內一周適應，期間予以自由飲食。

1.2 實驗試劑及器材

由無糖型強力枇杷露的廠家提供的10倍濃縮的無糖型強力枇杷露（所有成分和輔料都等比例濃縮10倍）以及未添加罌粟殼成分的無糖型強力枇杷露的10倍濃縮的溶媒試劑；大鼠灌胃針；5 mL注射器；消毒酒精；電子秤。

1.3 給藥方式及分組

SD大鼠的給藥方式為灌胃。通過上下法來進行試驗，雖然對于測試未知藥物LD50的推薦起始劑量為175 mg·kg-1[14]，但根據既往嗎啡半數致死量的研究，我們將無糖型強力枇杷露測試的初始劑量按照其中所含嗎啡的量來計算。嗎啡LD50的范圍在151～257 mg·kg-1[15]，按照250 mg·kg-1來計算，無糖型強力枇杷露中嗎啡的檢測濃度為0.096 mg·mL-1[16]，算出SD大鼠無糖型強力枇杷露的LD50初始測試劑量為2 600 mL·kg-1（250 mg·kg-1/0.096 mg·mL-1≈2 600 mL·kg-1），每只SD大鼠體重按0.2 kg來計算，每日灌胃的劑量為2 600 mL，這在實驗操作過程中是不可能完成的，我們將用10倍濃縮無糖型強力枇杷露、10倍濃縮的溶媒試劑來減少灌胃量。使用10倍濃縮液后，每只SD大鼠的每日灌胃量為52 mL（液體是蒸餾水時，大鼠最大灌胃體積為80 mL·kg-1[17]），灌胃頻率為5 mg·1.5 h-1。

將SD大鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組予以含有罌粟殼的10倍濃縮無糖型強力枇杷露，對照組則予以對應劑量的10倍濃縮的溶媒試劑。

1.4 實驗方法

在此實驗中我們采取序貫法來測試無糖型強力枇杷露的LD50，這個方法包括兩個實驗，限度實驗和主實驗。

1.4.1 限度實驗步驟

在限度實驗中，采用初始劑量無糖型強力枇杷為2 600 mg·kg-1對SD大鼠進行灌胃，若第一只SD大鼠灌胃后（兩周內）死亡，則直接進入主實驗，LD50＜2 600 mg·kg-1；若第一只大鼠存活，將該劑量繼續給予另外兩只大鼠，若兩只都存活則存活的SD大鼠總數達到3只，LD50≥2 600 mg·kg-1；如果至少有一只大鼠死亡，該劑量繼續給予另外兩只大鼠，直到存活或死亡的大鼠總數達到3只。根據限度實驗的結果可估計LD50是否高于此劑量。

圖1 限度實驗的實驗流程

1.4.2 主實驗步驟

根據限度實驗的結果，無糖型強力枇杷露的LD50低于2 600 mg·kg-1（相當于給予每只大鼠10倍濃縮無糖型強力枇杷露52 mL），因此主實驗中采用該劑量作為第一只SD大鼠的灌胃劑量。在第一只之后的SD大鼠我們將遵循急性藥理毒性試驗指南一般原則。在急性藥物毒性試驗指南中，所選劑量可從以下序列中選擇：1.75 mg·kg-1、5.5 mg·kg-1、17.5 mg·kg-1、55 mg·kg-1、175 mg·kg-1、550 mg·kg-1、1 750 mg·kg-1、5 000 mg·kg-1……[14]。在決定是否對下一只動物灌胃之前，每只SD大鼠都應認真觀察48小時，后一只動物劑量的上升或下降由前一只動物的死亡或存活決定；從第1只動物改變算起到停止試驗標準之一，停止實驗，計算LD50。無糖型強力枇杷露大概的LD50根據公式lgLD50=Σ（nX）/Σn計算，其中n是每個劑量的動物總數，X是每個劑量的對數劑量，取反對數就可以獲得大概的無糖型強力枇杷露的LD50。

當滿足下列停止實驗標準之一時，停止實驗：

（a）連續3只動物存活；

（b）任意連續的6只SD大鼠中有5只連續發生存活/死亡轉換；

（c）第一只SD大鼠發生存活/死亡轉換之后，至少有4只SD大鼠進入試驗，并且其LD50估算值的范圍超出臨界值（2.5倍）。（首次轉換的第4只SD大鼠之后，對每次給藥進行計算）。

圖2 主實驗的實驗流程

1.4.3 其他觀察指標

每天灌胃后連續觀察動物的反應，至少14天，每隔一天觀察一次，以便能觀察到毒性反應出現的時間及其恢復時間、動物死亡時間等。觀察的指標包括一般指標（如動物外觀如何、活動情況、對刺激的反應、分泌物、排泄物等）、動物的死亡情況（死亡的時間、瀕死前的反應等）等。記錄所有的死亡情況、出現的癥狀，以及癥狀起始的時間、嚴重程度、持續時間等。

所有的試驗動物均要進行大體解剖，包括在試驗過程中因為瀕死而被處死的動物、在實驗過程中死亡的動物及試驗結束時仍然存活的動物。解剖后發現組織器官出現體積、顏色、質地等方面的改變時，均應予以記錄并對其進行病理學檢查。

2 結果

2.1 限度實驗結果

在限度實驗中，第一只SD大鼠在第四次灌胃后死亡，即20 mL后死亡，按照指南的實驗步驟，我們應該進入主實驗，但是為了降低操作對SD大鼠造成意外死亡的可能，我們又進行了兩對灌胃操作。三對結果如表1所示：

表1 限度實驗灌胃后SD大鼠的狀態

由限度實驗結果，可以推測無糖型強力枇杷露的LD50低于2 600 mg·kg-1。

2.2 主實驗結果

主實驗結果如表2所示，首只SD大鼠灌胃量為52 mL（2 600 mg·kg-1），灌胃后大鼠死亡；前一只大鼠死亡，故第2只大鼠的灌胃量選擇低一級的劑量35 mL（1 750 mg·kg-1），灌胃后死亡；故第3只大鼠灌胃劑量為11 mL，灌胃后存活；第4只大鼠灌胃劑量為35 mL，灌胃后死亡；第5只大鼠灌胃劑量為11 mL（550 mg·kg-1），灌胃后存活；第6只大鼠灌胃劑量為35 mL，灌胃后死亡；第7只大鼠灌胃劑量為11 mL，灌胃后存活。此時，從第3只大鼠起到第7只大鼠連續5次發生存活/死亡轉換，滿足了停止實驗標準的第二條，實驗停止，不再對序列中1.75 mg·kg-1、5.5 mg·kg-1、17.5 mg·kg-1、55 mg·kg-1等劑量進行實驗。根據公式計算得出lgLD50等于3.05，無糖型強力枇杷露在雌性SD大鼠的LD50大概值為1 122 mg·kg-1。

表2 主實驗各劑量級灌胃后實驗組SD大鼠的狀態

2.3 其他觀察指標

在限度實驗和主實驗的實驗過程中，每只予以劑量為175 mg·kg-1及300 mg·kg-1的10倍無糖型強力枇杷露時，實驗組SD大鼠在第3次灌胃后，即15 mL濃縮藥物出現腹部隆起，可觸及腸型；行為方面實驗組較對照組掙扎減少，反射減少，尿量及排便減少，按及膀胱處有尿液排出，口唇的分泌物減少，并在實驗操作當天死亡；而對照組在灌胃相同次數及劑量時，腹部未見明顯隆起，腸型觸及不明顯，活動及反射均較實驗組好，但也弱于灌胃前的狀態，糞便排出由干燥到稀松。這些實驗組SD大鼠均在第四次灌胃后1小時左右死亡，死亡之前呼吸變得深而慢，活動能力明顯下降。每只予以劑量為55 mg·kg-1的10倍濃縮枇杷露時，雖然SD大鼠的活動減少，腹部稍有膨隆，但其反射存在，有明顯的應激反應。經過14天的觀察，實驗組存活的SD大鼠在第三天逐漸恢復飲食，大小便恢復至正常顏色及狀態；相應的對照組活動可，在觀察的第二天，大小便恢復至正常顏色及狀態。

每只實驗組的SD大鼠死后及經過14天觀察期的SD大鼠，都予以了大體解剖，解剖后發現在實驗操作當天死亡的實驗組SD大鼠的肺葉明顯減小；胃腸道組織蓄積較多的藥品濃縮液，膀胱充盈。存活下來的實驗組SD大鼠及對照組SD大鼠在麻醉后解剖，肺葉未見明顯萎縮，胃腸道中未見明顯液體殘留，膀胱未見明顯充盈。

3 討論

3.1 無糖型強力枇杷露LD50評價

藥物的急性毒理作用一般通過測定動物的LD50及最大給藥量來衡量[18]，在本研究中我們通過LD50 來評價無糖型強力枇杷露的安全性。在本實驗中，根據上下法測得的無糖型強力枇杷露的LD50的估計值為1 122 mg·kg-1。根據GHS急性經口毒性分級原則，無糖型強力枇杷露的毒性屬于低毒水平[19]。無糖型強力枇杷露臨床推薦劑量為每日45 mL，一個成年人（按體重為60 kg來計算）每天無糖型強力枇杷露的劑量為0.75 mg·kg-1，參考徐叔云《藥理實驗方法學》轉化，按體表面積計算等效劑量的比值來計算，人與SD大鼠的轉換系數為6.3，SD大鼠的臨床每日推薦劑量為4.725 mg·kg-1，遠遠低于其LD50。既往對于枇杷露類的研究多側重于成分、質量及臨床應用[20]，本研究首次通過上下法測定無糖型強力枇杷露的LD50，結果顯示該藥物的毒性作用較低。

3.2 生理狀況及解剖結果評價

在給SD大鼠灌胃過程中，觀察到SD大鼠在灌胃15 mL的10倍濃縮液后，相當于成人劑量7 143 mL（15 mL×10 / 0.2 kg×60 kg / 6.3=7 143 mL），SD大鼠的活動明顯減少，呼吸開始變得急促，腹部可觸及腸型，刺激肛門時，SD大鼠的大小便較對照組明顯減少，表示藥物抑制了消化系統及泌尿系統的功能。在灌胃20 mL的濃縮液后，相當于成人劑量9 524 mL（20 mL×10 / 0.2 kg×60 kg / 6.3=9 524 mL），SD大鼠死亡，解剖后發現SD大鼠的肺部明顯萎縮，胃腸道內充滿藥物，膀胱也是充盈狀態。以上實驗結果都顯示無糖型強力枇杷露在大劑量使用時具有鎮靜、抑制呼吸、抑制胃腸蠕動及排空、引起尿潴留的作用。

3.3 阿片類物質的影響

無糖型強力枇杷露中含有罌粟殼，其中的嗎啡及可待因等成分都屬于阿片類物質。阿片類物質能通過血腦屏障，抑制中樞神經系統的功能，產生鎮靜作用[21]；阿片類物質還能抑制消化系統的腺體分泌，導致胃排空延遲，幽門及回盲括約肌運轉延遲[22]；在過量使用時，還會導致呼吸抑制的嚴重不良事件[23]；對于泌尿系統的影響是會引起尿潴留，主要是由于阿片類物質影響抗利尿激素的釋放，并導致尿道平滑肌痙攣[24]。由于對照組SD大鼠未出現上述毒性反應，提示無糖型強力枇杷露中含有的罌粟殼可能是導致呼吸、消化和泌尿系統毒性的主要因素。

3.4 輔料的影響

苯甲酸鈉是無糖型強力枇杷露的輔料之一，是一種常見的防腐劑。苯甲酸鈉會干擾微生物細胞膜的通透性，影響細胞膜對氨基酸的吸收；苯甲酸分子進入細胞內后，會抑制微生物細胞內的呼吸酶系統，使微生物ATP的產生減少或停止，從而起到防腐的作用[25]。在主實驗和限度實驗中，對照組SD大鼠經過不含罌粟殼的10倍濃縮溶媒試劑灌胃后，在14天的觀察期內均存活，且未見明顯的毒性作用，該結果提示無糖型強力枇杷露中的輔料苯甲酸鈉可能不是其產生毒性反應的主要因素，即便如此苯甲酸鈉的毒性也不可忽視。

綜上所述，無糖型強力枇杷露的毒性分級屬于低毒水平，其中的罌粟殼及苯甲酸鈉等成分在既往研究中都明確表示過量會產生毒理反應，因此在臨床使用時要嚴格根據使用說明書及醫囑服藥。

4 結論

無糖型強力枇杷露的LD50約為1 122 mg·kg-1，毒性分級屬于低毒等級，根據無糖型強力枇杷露的推薦臨床服用劑量是安全的，并不會引起上述的毒理反應。但使用過大劑量時對SD大鼠胃腸蠕動、呼吸、泌尿及行為反射都有抑制作用，嚴重時會導致SD大鼠的死亡。