艾苓強身凝膠膏劑改善免疫低下小鼠免疫功能研究

侯冰妍，于 丹，都曉偉

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

免疫功能低下是人體產(chǎn)生疾病的首要內(nèi)在因素，輕則使人較容易受到外界病毒入侵，疾病發(fā)生頻率增加，影響生活質(zhì)量；重則因?qū)Π┳兗?xì)胞清除不力，導(dǎo)致腫瘤出現(xiàn)[1-3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣與血同源于水谷精微，經(jīng)肺、脾等臟器的功能活動而化生，是構(gòu)成和維持人體生命活動的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，二者相輔相成，氣虛則不能生血，血虛則無以化氣，所以氣虛和血虛常同時存在[4]。長期氣血虛會因臟腑缺乏正常滋養(yǎng)而功能失調(diào)，導(dǎo)致人體免疫力下降[5-6]。艾苓強身凝膠膏劑由白術(shù)、黨參、當(dāng)歸、茯苓等多味中藥提取加工制成，用于面色蒼白或萎黃，頭暈?zāi)垦＃募率撸闹氲。}細(xì)弱或虛大無力等，可以氣血雙補，益五臟，溫補保健。本研究對艾苓強身凝膠膏劑改善免疫低下小鼠的免疫功能作用進行研究，為其開發(fā)與應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

ICR純種小鼠，SPF級，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供。

1.2 藥品與試劑

乙酰苯肼（APH）（批號L1705044）、環(huán)磷酰胺（CTX）（批號L1812016），購于阿拉丁試劑（上海）有限公司；白細(xì)胞介素2（IL-2）酶聯(lián)免疫試劑盒、γ-干擾素（IFN-γ）酶聯(lián)免疫試劑盒、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫試劑盒、免疫球蛋白G（IgG）酶聯(lián)免疫試劑盒，購于R&D Systems China；艾苓強身凝膠膏劑，自制；防感冒穴位治療貼（具有增強體質(zhì)，提高免疫力，平衡陰陽作用），濰坊九康醫(yī)療器械有限公司。

1.3 儀器

AB204-N型電子分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司），OSB-2100型EYELA水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司），H1850型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），SPECTROstar Nano酶標(biāo)儀（The Microplate Reader Company）。

1.4 方法

1.4.1 實驗造模、分組與給藥 選取小鼠60只，雌雄各半，除去背部被毛，隨機分為6組，分別為空白組、模型對照組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。除空白組以外，其余各組小鼠分別于第1天（20 mg·kg-1）、第5天（40 mg·kg-1）皮下注射2%乙酰苯肼，于第5天開始腹腔注射1%的環(huán)磷酰胺（40 mg·kg-1），連續(xù)4 d，造成氣血虛免疫低下模型[7-9]，空白組注射等劑量的生理鹽水。陽性組粘貼防感冒穴位治療貼（0.62 g·kg-1，1.8 cm×0.7 cm），艾苓強身凝膠膏劑低（0.28 g·kg-1，1.2 cm×0.5 cm）、中（0.56 g·kg-1，1.5 cm×0.8 cm）、高（1.12 g·kg-1，2.0 cm×1.2 cm）劑量組分別粘貼艾苓強身凝膠膏劑，將相應(yīng)大小的藥片貼于小鼠背部脫毛區(qū)，固定，連續(xù)給藥15 d。

1.5 測定指標(biāo)

1.5.1 小鼠臟器指數(shù)的測定 于末次給藥后24 h，脫臼處死小鼠，取出胸腺和脾臟，稱質(zhì)量。計算胸腺、脾臟指數(shù)[10]。胸腺指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g），脾臟指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）。

1.5.2 對小鼠遲發(fā)型過敏反應(yīng)（DTH）影響測定 給藥第10日，使用5%硫化鈉溶液將腹部脫毛，范圍約3 cm×3 cm，用二硝基氟苯（DNFB）溶液50 μL涂于腹部致敏，致敏后第5天，用DNFB溶液10 μL均勻涂于小鼠的右耳（內(nèi)外兩面）進行攻擊。攻擊后24 h，脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm的耳片，稱質(zhì)量，測定耳腫脹度以左右耳片之差表示DTH強度[11-12]。耳腫脹度（mg）＝右耳質(zhì)量（mg）-左耳質(zhì)量（mg）。

1.5.3 小鼠血清中免疫分子測定 于末次給藥后，眼眶取血，靜置，離心制備血清。按照試劑盒說明書ELISA法檢測IL-2、TNF-α、IFN-γ及IgG水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

各組實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件做統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠臟器指數(shù)的測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著變化（P＜0.01），說明免疫低下小鼠模型復(fù)制成功；與模型組比較，艾苓強身凝膠膏劑中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05），脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05），說明艾苓強身凝膠膏劑對APH和CTX所致小鼠免疫器官指數(shù)變化有顯著的拮抗作用，見表1。

表1 艾苓強身凝膠膏劑對免疫低下狀態(tài)小鼠臟器指數(shù)的影響（±s，n=10）

表1 艾苓強身凝膠膏劑對免疫低下狀態(tài)小鼠臟器指數(shù)的影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1）胸腺指數(shù)/（mg·g-1）脾臟指數(shù)/（mg·g-1）空白組 / 2.83±0.60 4.38±0.72模型組 / 1.16±0.27## 7.14±1.27##陽性對照組 0.62 1.85±0.32△△ 5.50±0.90△△低劑量組 0.28 1.27±0.39 6.48±1.13中劑量組 0.56 1.51±0.28△ 6.21±0.82△高劑量組 1.12 1.91±0.48△△ 5.16±1.28△△

2.2 艾苓強身凝膠膏劑對免疫低下狀態(tài)小鼠血清中免疫分子影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中的IL-2、IFN-γ、TNF-α、IgG含量水平均顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，艾苓強身凝膠膏劑的中、高劑量組小鼠血清中的IL-2、IFN-γ、TNF-α、IgG含量水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），說明艾苓強身凝膠膏劑具有提高免疫功能低下小鼠血清中免疫分子含量水平的作用。見表2。

表2 艾苓強身凝膠膏劑對免疫低下狀態(tài)小鼠血清中免疫分子影響（±s，n=10）

表2 艾苓強身凝膠膏劑對免疫低下狀態(tài)小鼠血清中免疫分子影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1） IL-2/（pg·mL-1） IFN-γ/（pg·mL-1） TNF-α/（pg·mL-1） IgG/（mg·mL-1）空白組 / 99.68±16.71 60.60±8.11 167.65±41.43 29.01±7.52模型組 / 44.27±8.10## 43.71±7.77## 87.66±18.61## 14.26±3.53##陽性對照組 0.62 60.43±16.23△ 55.29±5.81△△ 124.25±28.63△ 24.90±4.78△△低劑量組 0.28 46.92±7.48 48.19±9.52 99.42±26.35 17.52±5.03中劑量組 0.56 58.24±12.58△ 49.90±5.01 113.55±27.15 20.54±3.73△高劑量組 1.12 61.65±12.23△△ 54.45±7.50△△ 127.26±32.02△△ 25.06±5.86△△

2.3 艾苓強身膠膏劑對免疫低下狀態(tài)小鼠耳腫脹度影響

與正常組比較，模型組小鼠的耳腫脹度明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，艾苓強身凝膠膏劑低、中劑量組小鼠的耳腫脹度呈上升趨勢，但未見顯著性差異，高劑量組小鼠耳腫脹度顯著升高（P＜0.05），提示艾苓強身凝膠膏劑可以增強氣血虛免疫低下小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。見表3。

表3 艾苓強身膠膏劑對免疫低下狀態(tài)小鼠耳腫脹度影響（±s，n=10）

表3 艾苓強身膠膏劑對免疫低下狀態(tài)小鼠耳腫脹度影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05

組別 劑量/（g·kg-1） 耳腫脹度/mg空白組 / 1.59±0.40模型組 / 0.61±0.31##陽性對照組 0.62 0.97±0.16△低劑量組 0.28 0.70±0.33中劑量組 0.56 0.76±0.24高劑量組 1.12 0.99±0.32△

3 討論

胸腺是T淋巴細(xì)胞分化、成熟的場所，可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，是自身免疫耐受建立與維持的重要場所[13-15]；脾臟是機體中最大的外周免疫器官，90%血液通過血液循環(huán)經(jīng)過脾臟[16]。血液中的外源性病原微生物或其他有毒有害物質(zhì)，可以通過脾臟的濾過作用被清除。胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的變化能夠較為客觀地反映機體免疫功能的變化，器官過大或過小都是免疫功能異常的表現(xiàn)[17-18]。小鼠注射乙酰苯肼、環(huán)磷酰胺后，胸腺、脾臟指數(shù)有顯著性異常變化，反映出機體免疫功能受損，經(jīng)艾苓強身凝膠膏劑治療后，小鼠胸腺指數(shù)顯著上升、脾臟指數(shù)顯著下降，表明艾苓強身凝膠膏劑對免疫低下小鼠的免疫器官功能有較好的恢復(fù)作用。

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的一種類型，也是常見的一種免疫反應(yīng)[19-20]。DNFB稀釋液可與腹壁皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞，涂于耳部進行再次攻擊后，使局部腫脹，其腫脹程度可以反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度，即反映了機體T細(xì)胞免疫反應(yīng)的強弱[21]。實驗結(jié)果顯示，艾苓強身凝膠膏劑可以顯著升高小鼠耳腫脹度，具有通過活化T細(xì)胞增強機體細(xì)胞免疫功能的作用。

IL-2是一種可以激活T細(xì)胞并且維持其增殖、活化和穩(wěn)定T細(xì)胞亞群的細(xì)胞因子，還具有刺激NK細(xì)胞增殖等多重免疫功能[22-24]；IFN-γ可以通過增強巨噬細(xì)胞抗原遞呈能力和殺傷活性，活化NK細(xì)胞，使其細(xì)胞毒作用增強等多種機制調(diào)節(jié)人體的免疫應(yīng)答[25]；TNF-α可以使T細(xì)胞增殖，活化NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，發(fā)揮免疫作用[26]；血清中IgG在5種免疫球蛋白中含量最高，并在機體的抗感染、抗病毒、抗毒素等作用中發(fā)揮“主力軍”作用，是參與體液免疫的重要免疫球蛋白[27-28]。以上這些免疫分子是發(fā)揮體液免疫和細(xì)胞免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究顯示，與正常組比較，模型組的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IgG等免疫分子水平顯著性降低，說明小鼠的免疫功能受到抑制；在給予艾苓強身凝膠膏劑后，血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α和IgG等免疫因子水平明顯提高，與模型組有顯著性差異（P＜ 0.05，P＜0.01），說明艾苓強身凝膠膏劑具有提高機體體液免疫和細(xì)胞免疫功能的作用。

綜上所述，艾苓強身凝膠膏劑能夠提高免疫力低下小鼠免疫功能，具有較大的開發(fā)與實際應(yīng)用價值，但其具體作用機制仍有待進一步深入研究。