蒼附導痰丸上調TNF-α并激活P65和JNK改善多囊卵巢綜合征的研究

★ 駱世存 黃長盛 凌靜 彭小鵬 張玲玲 吳惠君（.深圳市中醫院婦產科 廣東 深圳58033；.華中科技大學協和深圳醫院/深圳市南山區人民醫院 廣東 深圳 5805）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種常見的復雜異質性內分泌疾病，育齡婦女發病率大約為5 %～10 %［1］。根據2003年修訂的PCOS診斷標準專家共識，同時存在稀發排卵或無排卵，雄激素過多癥和多囊卵巢形態三個特征中的兩個，同時排除其它病因即可診斷為PCOS［2］。PCOS可出現月經功能障礙、肥胖、痤瘡、多毛癥和代謝綜合征，但其潛在機制尚未明確［3-4］。目前已證實口服避孕藥（OCP）、克羅米芬檸檬酸鹽（CC）和二甲雙胍等藥物可治療月經不調、誘導排卵并調節高雄激素血癥［5］。但OCP對部分患PCOS的女性有禁忌癥，CC雖可有效誘導排卵但懷孕率非常低，而二甲雙胍也會引起胃腸道疾病等不良反應，因此尋找治療PCOS的替代藥物迫在眉睫［6］。目前中藥逐漸在PCOS治療中發揮重要作用，研究表明吳麗麗等自擬溫經消瘕湯可降低PCOS患者的胰島素抵抗程度［7］；陳氏育卵湯能改善PCOS患者高雄激素狀態，促進卵泡發育［8］；補腎化痰活血方聯合針灸能明顯改善PCOS不孕患者子宮內膜容受性，提高妊娠率［9］。蒼附導痰丸（CFDT）是一種中國傳統的中藥配方，已證明可有效緩解PCOS患者癥狀，如增加排卵率、減輕肥胖、調節內分泌紊亂等，從而改善PCOS患者的妊娠結局［10］。但目前對其分子調節機制的研究仍然十分有限。PCOS患者長期處于一種慢性炎癥狀態，患者體內腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子水平升高，同時炎癥相關信號通路核因子κB（NFκ-B）轉錄因子p65和N-末端激酶（JNK）蛋白激酶被激活［11-13］。在本研究中，我們旨在探討TNF-α水平升高，NFκB通路中p65和JNK的失調是否參與PCOS致病機制，并評價CFDT在大鼠PCOS模型中的療效。

1 材料與方法

1.1 動物分組 研究納入40只6周齡SPF雌性SD大鼠（購自中國中山大學實驗動物中心），在喂食一周后隨機分成4組（每組10只），分別為：正常對照組，PCOS模型組（PCOS），PCOS+CFDT實驗組（PCOS+CFDT），PCOS+克羅米芬檸檬酸鹽陽性對照組（PCOS+CC）。

1.2 PCOS大鼠模型的構建和干預 將納入的6周齡SPF雌性SD大鼠皮下注射脫氫表雄酮（30 mg/kg/d）和0.2 mL注射用油劑，隨后持續4周對大鼠皮下注射胰島素（2 IU/d）（諾和靈，美國）構建PCOS模型。PCOS模型組：造模后第1～14 d給予生理鹽水；PCOS+CFDT實驗組，造模后第1～14 d灌胃蒼附導痰丸水提濃縮液24g/kg/d；PCOS+CC陽性對照組：造模后第1～14 d灌胃克羅米芬懸液20 mg/kg/d。蒼附導痰丸（CFDT）加減配方（中國中藥深圳市中醫院制劑中心中藥實驗室）：蒼術10 g、香附10 g、制半夏10 g、橘紅10 g、白茯苓15 g、炙甘草10 g、菟絲子15 g、柴胡10 g、白芍10 g、生地20 g、川芎10 g、黃芪20 g、黃芩10 g等十三味中藥組成，水提2次，濃縮，含生藥2.5 g/mL，4 ℃保存。

1.3 指標觀察

1.3.1 體重和性激素水平測量 藥物處理后第14 d記錄大鼠體重，然后腹膜內注射0.3 mL 2%戊巴比妥麻醉大鼠，收集血液。以3 000 rpm的速度離心20 min后，通過酶聯免疫吸附測定試劑盒（Adlitteram Diagnostic Laboratories，CA，USA） 測量睪酮（T）和雌二醇（E2）的血清水平，按說明書進行操作。

1.3.2 卵巢形態 解剖卵巢組織并在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中洗滌，制備石蠟包埋切片，用10%多聚甲醛固定5 h后，將切片脫水并包埋在石蠟中并用蘇木精和伊紅染色，脫水、透明、封片后用顯微鏡下評估卵巢形態。

1.3.3 免疫組化（IHC） 用10%多聚甲醛固定包埋切片并用1%Triton X-100透明化。用PBS洗滌兩次后，在4℃下分別與TNF-α抗體（SC-52746，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），TNF R1抗 體（SC-8436，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），TNF R2抗體（SC-8041，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），p-p65抗 體（SC-136548，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），p65 抗體（CST-8242，Santa Cruz，CA，USA ，1∶50） ，JNK 抗 體（SC-7345，Cell Signal Technology，MS，USA，1∶200） 和 p-JNK 抗 體（SC-135642，Santa Cruz，CA，USA，1∶100） 孵育過夜。洗滌兩次后，將切片與二抗一起孵育1 h后，用3,3-二氨基聯苯胺（DAB）染色并在顯微鏡下測定這些蛋白質的相對表達量。

2 結果

2.1 CFDT改善大鼠模型的PCOS綜合征 給藥前，各組PCOS大鼠體重無顯著差異，且均高于正常對照組（對照組），提示PCOS造模成功。給藥后，與PCOS模型組相比，PCOS+CFDT和PCOS+CC中大鼠體重顯著降低（圖1A）。HE染色結果顯示，正常組卵巢組織結構清晰，形態完整，卵泡中有多個顆粒細胞，有卵母細胞和輻射冠。相反，PCOS組的卵巢組織紊亂，白膜表面增厚，組織中有不同階段的卵泡，包括閉鎖卵泡和囊性擴張的卵泡。卵泡中顆粒細胞的數量顯著減少，卵泡和輻射冠中沒有卵母細胞。 PCOS + CFDT和PCOS + CC組大鼠卵巢組織的結構和形態無明顯異常（圖1B）。與正常組相比，PCOS模型組血清睪酮（T）和雌二醇（E2）水平顯著上調，而PCOS + CFDT和PCOS + CC組的血清T和E2水平低于PCOS組（圖1C-D）。

圖1 CFDT對體重，卵巢形態和性激素的影響。

2.2 CFDT可逆轉PCOS大鼠TNF-α，TNF R1和TNF R2的表達 IHC結果提示，與正常大鼠卵巢組織相比，PCOS模型組的卵巢組織中TNF-α，TNF R1和TNF R2的表達水平顯著上調。與PCOS組相比，PCOS+CFDT和PCOS+CC組卵巢組織中TNF-α，TNF R1和TNF R2的表達水平顯著下調，且與正常大鼠的水平無顯著差異，見圖2。

圖2 各組TNF-α，TNFR1和TNFR2表達水平

2.3 CFDT抑制PCOS大鼠p65和JNK的活化 與正常組的卵巢組織相比，PCOS模型組卵巢組織中p-p65和p65的表達顯著上調。而PCOS + CFDT和PCOS + CC組大鼠卵巢組織中p-p65和P65的表達水平顯著低于PCOS模型組，并與正常組蛋白表達水平無顯著差異，見圖3。此外，與正常組相比，PCOS模型組卵巢組織中p-JNK的表達上調。與PCOS模型組大鼠相比，PCOS+CFDT和PCOS+CC組大鼠卵巢組織中p-JNK的表達水平顯著下調，與正常組相比無統計學差異。各組間JNK總蛋白表達水平無明顯變化。

圖3 各組p65，p-p65，JNK和p-JNK表達水平

3 討論

本研究證實了CFDT可改善卵巢形態，并發揮了類似CC的療效，可下調性激素水平，在CFDT和CC處理的PCOS大鼠中高表達的TNF-α及兩個下游受體TNFR1和TNFR2表達水平顯著降低。PCOS模型大鼠中p65和p-p65高表達，而CFDT和CC處理可抑制其表達。同時PCOS大鼠中p-JNK明顯升高，而各組間JNK無明顯變化，提示PCOS大鼠模型中，p65和JNK的激活與CFDT丸的作用有關。

CC用于PCOS患者在無排卵PCOS中誘導排卵，經濟成本低，不良反應風險也較低。然而，大約15 %～40 %PCOS患者對CC沒有治療反應，CC對妊娠結局的影響仍然不能令人滿意［14］。中藥可為PCOS女性提供替代療法。有研究表明CFDT對PCOS治療有益，這也在本研究中被證實［10］。本研究發現，CFDT可減輕體重，減少顆粒細胞減少和卵巢功能紊亂，并逆轉PCOS大鼠失調的T和E2激素，避免機體出現胰島素抵抗和其它PCOS樣表現［15-16］。除此之外，通過使用CC作為陽性對照，進一步驗證CFDT在改善體重、卵巢形態和性激素方面具有與CC相同的效果。這些發現表明CFDT可能減輕了PCOS大鼠肥胖及排卵功能障礙，并可作為對CC沒有反應的PCOS女性的替代療法。

PCOS的確切病因尚不清楚，遺傳和環境特征被認為是相關的影響因素［17］。一項研究表明，PCOS表現為低度促炎狀態，外周循環測定顯示一組細胞因子，包括TNF-α、一種已知的胰島素抵抗的促炎介質均在PCOS女性中升高［18］。此外，先前的研究表明TNF-α誘導的炎癥狀態將直接上調卵巢卵泡膜細胞類固醇生成酶，促進多囊卵巢中雄激素的產生［19］。

P65是核因子 κB（NF-κB）的亞基，可被TNF-α磷酸化。在某些情況下，p65的激活與JNK的磷酸化有關［20］。據報道，正常和超重PCOS患者的NF-κB通路中p65表達均高于沒有PCOS的患者［21］。p65可能促進TNF-α從循環的單核細胞中釋放，并導致進一步引發炎癥和胰島素抵抗。本研究觀察到CFDT可降低PCOS大鼠體重、下調TNF-α水平和升高TNF-α受體的表達。此外，還觀察到p65，p-p65和JNK的上調表達可被CFDT部分逆轉。本研究中應用CFDT治療可恢復可能由TNF-α誘導的p65和JNK的激活導致體重和性激素的上調，該結果提示TNF-α的上調和p65和JNK的激活與PCOS等有效治療有關，

綜上所述，CFDT可發揮與CC一致的對PCOS大鼠的保護作用，其機制可能與NF-κB p65和JNK的激活有關。