益氣活血軟堅解毒方聯合奧沙利鉑對H-22肝癌細胞的增效減毒作用

★ 張旼旼 黃新宇 戴慧（杭州市腫瘤醫院 杭州 310002）

原發性肝癌（簡稱肝癌）其中90 %為肝細胞肝癌，是全球最常見的惡性腫瘤之一，發病率居第六位，死亡率居第四位［1］。由于肝癌起病隱匿，多數患者初診時常為中晚期，已失去手術治療機會。以奧沙利鉑（OXA）為主的全身治療是治療肝癌的主要手段之一［2］。但OXA在化療過程中，經常出現神經系統毒性、惡心嘔吐、骨髓抑制、肝功能改變、免疫功能下降等不良毒性反應，加上晚期患者體力狀況評分低下，常導致患者化療不能耐受，致使化療周期延長或者化療藥物減量。益氣活血軟堅解毒方（YHRJ）是在歸納古代醫學文獻，結合幾十年臨床經驗主要用于肝癌患者的成熟方劑，研究已證實，YHRJ可以抑制肝癌的生長，提高患者生活質量，延長生存期［3］。本文以肝癌細胞H-22為研究對象，初步探討YHRJ對OXA的增效減毒作用。

1 材料與方法

1.1 動物、瘤株與藥物 BALB/c小鼠：體質量18～22 g，4周齡，雌雄各半，小鼠由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（滬）2013-0016。飼養條件：恒溫，溫度（22±2）℃，濕度50 %～60 %，光照每12 h明暗交替，換風次數15～20次/h。瘤株：H-22肝癌細胞,由賽百慷提供，貨號：HEPA1-6。藥物：益氣活血軟堅解毒方（YHRJ）組成：生黃芪30 g、炒白術15 g、田三七8 g、水紅花子8 g、藤梨根30 g、凌霄花9 g、炮山甲10 g、白花蛇舌草30 g、半枝蓮30 g，常規水提取，回流濃縮成浸膏，實驗時稀釋成等效劑量YHRJ 3.4 g/mL、高劑量YHRJ 6.8 g/mL，4 ℃保存備用。陽性對照藥物OXA：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司產品，用5 %葡萄糖液調配成1 g/L的溶液，遮光保存。

1.2 動物模型制備與分組 取48只小鼠，收集對數生長期H～22肝癌細胞，調整濃度為1×107個/mL，頸部右側皮下接種0.2 mL，繼續飼養于SPF環境，2-3周后待腫瘤增殖至可以觸及時，將動物隨機分為6組：A 對照（NS）組；B 奧沙利鉑（OXA）組；C等效劑量YHRJ（EYHRJ）組；D等效劑量YHRJ+OXA（EYHRJ+OXA）組；E 高劑量YHRJ（HYHRJ）組；F高劑量YHRJ+OXA（HYHRJ+OXA）組。

1.3 用藥 NS組及YHRJ單藥組采用灌胃的給藥方法，每天分別給于0.9 % NaCl及YHRJ（EYHRJ濃度為3.4 g/mL，HYHRJ濃度為6.8 g/mL）各0.3 mL，1次/d，連續14 d；OXA組采用腹腔注射OXA（劑量為1.5 mg/kg，用5 %葡萄糖液調配成0.5 mL/鼠，1次/d）連續14 d；聯合組每天灌胃給予不同劑量的YHRJ 0.3 mL及腹腔注射OXA 0.5 mL，1次/d，連續14 d。

1.4 生化及流式的試劑

表1 主要材料

1.5 實驗方法

1.5.1 抑瘤率 每隔3 d觀察腫瘤的生長情況，測量腫瘤長徑（L）和寬徑（W），單位為毫米（mm）。2周后處死小鼠，腫瘤體積=（L×W2）/2；腫瘤抑瘤率=［（A-B）/A］×100 %。（A：對照組腫瘤體積，B：給藥組腫瘤體積）。聯合作用評價 采用金氏公式評價藥物的聯合作用。金氏公式：Q = E（A+B）/（EA+EB-EA×EB）。EA、EB分別表示A和B兩種藥物單獨用藥的效應；E（A+B）表示藥物A和藥物B聯合用藥的效應。如果Q＞0.85為兩藥具有相加作用，Q＜0.85為拮抗作用。

1.5.2 血常規計數及瑞士-吉姆薩染色 用全自動血液分析儀檢測紅細胞（RBC）、白細胞（WBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）的數值。取小鼠骨髓液，離心后棄去上清，用生理鹽水稀釋下層沉淀，涂于載玻片上，自然風干，用瑞士-吉姆薩染液染色觀察骨髓有核細胞（BMC）。

1.5.3 YHRJ對小鼠肝臟功能的影響 采小鼠心臟血，離心分離血清，采用相應試劑盒測定血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）。取小鼠肝臟組織，加生理鹽水制備成肝組織勻漿，離心后取上清液，用γ-谷氨酰轉肽酶試劑盒測定肝臟中γ-谷氨酰肽轉肽酶（γ-GT）活性。

1.5.4 YHRJ對小鼠免疫細胞的影響 小鼠取脾臟，裂解后離心獲取淋巴細胞液，進行后續實驗。

T細胞亞群的檢測：取100 μL淋巴細胞懸液，加入1 μL FITC抗小鼠CD3、0.5 μL PE抗小鼠CD4、0.5 μL APC抗小鼠CD8a熒光抗體，進行細胞熒光染色40 min，設置單染及空白對照管；加入細胞洗滌液1.5 mL，振蕩混勻，1 500 r/min離心5 min，去上清；加入細胞保存液0.2 mL，振蕩流式檢測。

B細胞的檢測：取100 μL淋巴細胞懸液，加入單克隆抗體1 μL FITC抗小鼠CD3，1 μL APC抗小鼠CD19進行細胞熒光染色40 min，設置單染以及空白對照管；加入細胞洗滌液1.5 mL，振蕩混勻，1 500 r/min離心5 min，去上清；加入細胞保存液0.2 mL，振蕩懸浮細胞，流式檢測。

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，所有數據以均值±標準差（）表示。兩組間比較采用兩個獨立樣本的t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抑瘤率

圖1 YHRJ對小鼠肝癌的抑制作用

表2 各組小鼠腫瘤終體積及抑瘤率（ ，n=8）

圖1、表2可見，給藥2周后，除EYHRJ組外，其它組各腫瘤大小較NS組均明顯減?。≒＜0.05或P＜0.01）；兩聯合組的抑瘤率均達到35 %以上，兩聯合組腫瘤大小均小于OXA單藥組，其中，HYHRJ+OXA組較OXA單藥組有統計學差異（P＜0.01）。根據金正均公式計算結果，EYHRJ、HYHRJ與OXA聯合均具有相加作用，表明YHRJ能夠增強OXA的抑瘤作用。

2.2 YHRJ對小鼠血常規、骨髓有核細胞的影響 較NS組，OXA單藥組中RBC、WBC、HGB、PLT和BMC的數目均減少，其它各給藥組中上述細胞數目均增多。其中，EYHRJ組中，除WBC外，其余細胞的數目較NS組增多具有統計學差異（P＜0.05或P＜0.01）。該結果提示在腫瘤的治療過程中，YHRJ可以保護RBC、HGB、PLT及BMC。較OXA單藥組，兩聯合組中RBC、BMC細胞數目均明顯升高，表明YHRJ尤其可以保護RBC、BMC，具有抵抗OXA化療引起的骨髓抑制作用（表3和圖2）。

圖2 小鼠骨髓有核細胞吉姆薩染色圖（400倍）

表3 各組小鼠血常規細胞、骨髓有核細胞數目變化（ ，n=8）

2.3 YHRJ對小鼠肝功能的影響 表4中可見，與NS組比較，OXA組中除ALT值外，AST、ALP、γ-GT值均顯著上升（P＜0.01），EYHRJ組、HYHRJ組中除ALT外，AST、ALP、γ-GT值均顯著下降（P＜0.01），表明YHRJ可以降低肝功能指標，對肝功能具有保護作用;與OXA組比較，兩聯合組中除ALT值外，AST、ALP、γ-GT值也均顯著下降，提示YHRJ可減輕OXA引起的肝功能損害（P＜0.01）。

表4 YHRJ對小肝臟功能的影響（ ，n=8）

2.4 YHRJ對小鼠免疫細胞的影響 與NS組比，OXA單藥組給藥后CD3+T細胞（右下象限）、CD3+CD4+T細胞（右上象限）、CD3+CD8+T細胞（右上象限）、CD3-CD19+B細胞（左上象限）均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；EYHRJ組、HYHRJ組上述各淋巴細胞均顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）；與OXA相比，EYHRJ+OXA組中除CD3+CD4+T細胞外，其余各淋巴細胞均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），HYHRJ+OXA組各淋巴細胞群較OXA組則無顯著差異（表5和圖3-4）。該結果表明，YHRJ具有保護免疫細胞的功效，EYHRJ可以顯著改善OXA化療引起的免疫功能低下。

表5 YHRJ對小鼠淋巴細胞群的影響（ ，n=8） %

圖3 YHRJ對小鼠T淋巴細胞群的影響

圖4 YHRJ對小鼠B淋巴細胞的影響

3 討論

中醫學在治療惡性腫瘤方面有著固本培元的優勢，YHRJ是臨床常用的治療肝癌的中藥復方制劑，主要成份有生黃芪、炒白術、藤梨根、白花蛇舌草、半枝蓮、水紅花子、田三七、凌霄花、炮山甲等，其中，生黃芪、炒白術可扶正固本，藤梨根、白花蛇舌草能夠清熱解毒［4］，半枝蓮、水紅花子具有抗菌、激活增強機體免疫的功能［5-7］，田三七、凌霄花主治活血化淤［8］，炮山甲具有去瘀散結的功效［9］。扶正固本、清熱解毒、活血化瘀、軟堅散結是中醫藥治療癌癥的主要法則，且中藥復方制劑具有整體協同的作用，可通過抑制腫瘤細胞增殖，抑制血管生成、刺激免疫細胞、改善免疫功能等多個途徑控制腫瘤進展。

本研究結果中，YHRJ對H-22肝癌細胞移植瘤具有一定抑制作用，當與OXA聯合時，可增強其抑瘤作用，聯合用藥具有相加作用，抑瘤率可提高到35 %以上。YHRJ可回升造血細胞，尤其是紅細胞和骨髓有核細胞，改善肝功能，對OXA化療中引起的骨髓抑制、肝功能改變具有顯著的保護作用。YHRJ還可以調節免疫細胞，提高免疫功能。晚期肝癌的患者由于體力狀況不佳，免疫功能低下，往往不能耐受兩藥或者三藥方案的聯合化療。YHRJ具有抑制腫瘤增殖、保護骨髓造血細胞、改善肝功能、調節免疫功能的作用，與化療藥聯合，發揮其增效減毒的作用，為晚期肝癌的治療帶來新的思路和方法。在臨床使用時，可按照藥物在動物與人體間劑量換算原則來計算出適應人體的合適聯合用藥劑量［10］，但由于YHRJ為復方制劑，具體應用時，仍需考慮到患者的個體差異及需要實施醫師擁有更多的臨床經驗。