理性設計降低堿性蛋白酶的膠原降解活力

李 玉，李家霖，朱寶悅，劉佳萌，劉逸寒，路福平

(天津科技大學生物工程學院，天津300457)

蛋白酶是一種具有復雜結構與功能的水解酶，能夠裂解肽鍵產生短肽或氨基酸[1]．按照最適pH的不同，蛋白酶可分為3種類型：酸性蛋白酶，最適pH為2.0～5.0，主要來源于真菌；中性蛋白酶，最適pH為7.0，主要來源于植物；堿性蛋白酶，最適pH為8.0及以上[2]，主要來源于微生物．蛋白酶作為最重要的工業酶制劑之一，銷售額占所有酶制劑銷售量的60%以上，在洗滌劑、醫藥、食品、皮革、絲綢、攝影等領域有著廣泛的應用[1,3-5]．

在皮革工業中，脫毛是皮革加工的主要步驟，即去除皮革上的毛發、表皮、非膠原蛋白和其他黏合物質[6]．傳統的脫毛工藝使用的是硫化鈉，產生的大量含硫廢棄物導致了嚴重的污染問題[7-8]，此外，在制革鞣前準備中，大量的化工材料添加也造成了嚴重的環境隱患．目前，使用酶制劑代替化學品進行清潔化生產的相關應用在制革中受到越來越多的關注[9-10]．其中，蛋白酶作為脫毛工藝中硫化鈉的環境友好型替代品，已在皮革工業中應用．Dayanandan等[11]利用塔馬里曲霉(Aspergillus tamarii)來源的蛋白酶在pH 9～11、溫度30～37℃、酶質量分數1%、孵育時間18～24h的條件下對羊皮進行了脫毛，該方法顯著降低了脫毛過程中的五日生化需氧量(BOD5，50%)、化學需氧量(COD，40%)、溶解性總固體(TDS，60%)和懸浮性總固體(TSS，20%)．然而，由于傳統蛋白酶中的膠原降解蛋白酶活力較強，在應用過程中對皮膠原易造成損傷，導致松面、爛面等現象出現，極大降低了經濟效益，造成了蛋白酶在皮革工業中的應用局限性[12-13]．因此，開發一種適合皮革加工的、具有低膠原水解活性的蛋白酶能夠提高其在使用過程中的安全性，具有較高的應用需求與實踐價值．

由于克勞氏芽胞桿菌來源的堿性蛋白酶可以水解毛發，因此膠原蛋白水解能力也較高，造成在皮革工業中的應用受限．本研究以克勞氏芽胞桿菌來源的堿性蛋白酶(PRO)為研究對象，通過理性設計工具設計突變庫對PRO進行改造，以期獲得低膠原降解活力的蛋白酶突變體，旨在進一步提高該酶在皮革工業中的應用價值．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)WB600、解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、質粒pLY2-PRO均為本實驗室保存．

1.1.2 主要試劑及培養基

KOD-Plus點突變試劑盒，TOYOBO公司；質?？焖偬崛≡噭┖?，Omega 公司；蛋白胨和酵母浸粉，Oxoid公司；Ⅰ型膠原(可溶)，Solarbio公司；其他試劑均為國產分析純．

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，121℃高壓蒸汽滅菌 20min．

發酵培養基(g/L)：玉米淀粉64，豆類淀粉40，NaH2PO44，K2HPO40.3，高氏淀粉酶0.7，90℃保溫30min，121℃高壓蒸汽滅菌20min．

1.2 方法

1.2.1 PRO突變體的構建及表達

克勞氏芽胞桿菌來源的堿性蛋白酶(PRO)的晶體結構已在1998年得到了解析(PDB：1GCI)[14]．通過突變設計軟件HotSpot Wizard 3.0[15]設計突變庫．

本實驗室前期已經克隆了克勞氏芽胞桿菌堿性蛋白酶基因pro，并將其插入到pLY2載體中，構建了重組質粒pLY2-PRO[16]．設計突變體引物(表1)，通過KOD-Plus點突變試劑盒，以pLY2-PRO質粒為模板，經反向PCR引入突變位點構建重組質粒，轉入枯草芽胞桿菌WB600，涂布于卡那霉素抗性平板，挑取轉化子擴大培養后提取質粒進行測序驗證．測序正確的重組質粒參照楊連[17]的方法轉入解淀粉芽胞桿菌中．將重組菌株以2%的接種量接種到發酵培養基中，37℃、220r/min培養48h．取2mL菌液12000 r/min離心2min，取上清液用于聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測及酶活力測定．

表1 實驗所用引物 Tab. 1 Primers used in this study

1.2.2 蛋白酶活力測定

堿性蛋白酶活力測定根據GB/T 23527—2009方法，每組以1個試管為對照組，其余3個試管為實驗組．在所有試管中，加入1mL用硼酸緩沖液(pH 10.5)配制的1%的酪素溶液，并將試管在40℃保溫2min．向對照組試管中加0.4mol/L三氯乙酸2mL，向實驗組試管中加入1mL適當稀釋的酶液，40℃反應10min．反應后對照組試管加入1mL酶液，實驗組試管加入0.4mol/L三氯乙酸溶液2mL終止反應．分別從各試管中取1mL反應液，12000r/min離心1min，取0.5mL上清液于新的試管中，加入2.5mL碳酸鈉、0.5mL福林試劑，40℃顯色20min，在680nm處測定吸光度．酶活力定義為在40℃下每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸所需的酶量．

膠原蛋白降解活力測定根據Rosen法，每組以1個試管為對照組，其余3個試管為實驗組．在所有試管中，加入1mL用硼酸緩沖液(pH 10.5)配制的5mg/mL Ⅰ型膠原溶液，并將試管在40℃保溫2min．向對照組試管中加0.4mol/L三氯乙酸2mL，向實驗組試管中加入1mL適當稀釋的酶液，40℃反應10min．反應后對照組試管加入1mL酶液，實驗組試管加入0.4mol/L三氯乙酸溶液2mL終止反應．分別從各試管中取1mL反應液，12000r/min離心1min，取0.5mL上清液于新的試管中，加入0.5mL乙酸-乙酸鈉溶液(pH 5.4)、0.5mL茚三酮溶液，煮沸10min，冷卻后加入4.5mL 60%乙醇溶液，混勻，在570nm處測定吸光度．酶活力定義為在40℃下每分鐘水解Ⅰ型膠原產生1μg甘氨酸所需的酶量．

1.2.3 PRO突變體酶學性質測定

分別使用pH 7～9的磷酸鹽緩沖液(50mmol/L)和pH 10～12的硼酸緩沖液(50mmol/L)配制酪素溶液，測定40℃時不同pH條件下的酶活力．以最高酶活力為100%，計算不同pH下的相對酶活力，確定最適pH．

將酶液置于40℃的條件下，在7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的緩沖液中孵育20h后，測定殘余酶活力．以未孵育的酶活力為100%，計算不同pH孵育后的殘余酶活力，測定pH穩定性．

在最適pH環境下，分別測定30、40、50、60、70、80℃條件下的酶活力，以最高酶活力為100%，計算不同溫度下的相對酶活力，確定最適溫度．

將酶液置于最適pH緩沖液中，在不同溫度條件下保溫20h后，測定殘余酶活力．以未孵育的酶活力為100%，計算不同溫度孵育后的殘余酶活力，測定熱穩定性．

2 結果與分析

2.1 PRO突變點的選擇及突變庫構建

野生型PRO結構中Gly97-Gly102loop區域在其催化三聯體Asp-His-Ser附近(圖1)，通過分子動力學模擬發現(數據未顯示)，Gly97-Gly102loop區域會與底物分子接觸并相互作用，從而影響PRO的催化功能．

圖1 PRO的三維結構 Fig. 1 Three-dimensional structure of PRO

以RCSB數據庫PDB：1GCI為輸入文件，運用HotSpot Wizard 3.0設計了 PRO 位于 Gly97-Gly102loop區的突變庫．利用突變引物和KOD-Plus點突變試劑盒在pLY2-PRO質粒的pro基因處引入突變，成功構建pLY2-G97E等31個重組質粒(表2)．將重組質粒轉入枯草芽胞桿菌WB600中進行擴增及甲基化修飾．

表2 重組質粒 Tab. 2 Recombinant plasmid

2.2 PRO突變體在解淀粉芽胞桿菌中的表達

將測序正確的重組質粒轉入解淀粉芽胞桿菌，對重組菌株進行發酵表達，菌液離心后取上清液為粗酶液．將粗酶液置于截留相對分子質量為1.0×104的超濾管中，3800g離心30min，取濃縮液用于SDSPAGE檢測，結果如圖2所示．在相對分子質量為3.0×104處出現一個明顯的單一蛋白條帶，與目的蛋白理論大小相符，證明PRO突變體在解淀粉芽胞桿菌中成功分泌表達，且經超濾后純度較高，可用于后續分析和研究．

圖2 部分PRO突變體的SDS-PAGE分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of partial PRO mutant

2.3 PRO突變庫的篩選

將濃縮液稀釋適當倍數后，分別測定PRO突變體的堿性蛋白酶活力及膠原蛋白降解活力．以野生型(WT)PRO的堿性蛋白酶活力和膠原蛋白降解活力為100%，計算各突變體的堿性蛋白酶相對活力和膠原蛋白降解相對活力，結果如圖3所示．

與野生型PRO的堿性蛋白酶活力和膠原蛋白降解活力相比，大部分突變體堿性蛋白酶活力與膠原蛋白降解活力下降幅度無顯著差異，G97M、S99G、S99M和S99P等突變體的膠原蛋白降解活力下降幅度顯著低于堿性蛋白酶活力的下降幅度，僅G97E突變體的膠原蛋白降解活力下降幅度顯著高于堿性蛋白酶活力的下降幅度．G97E突變體的堿性蛋白酶活力和膠原蛋白降解活力分別為野生型PRO的91.97%和65.84%，堿性蛋白酶活力損失在10%以內，而膠原蛋白降解活力降低了三分之一以上，表明G97E突變體在幾乎不損失蛋白酶活力的情況下，顯著降低了對于膠原蛋白的水解能力．

圖3 PRO突變體的堿性蛋白酶相對活力及膠原蛋白降解相對活力 Fig. 3 The alkaline protease relative activity and collagen degradable relative activity of PRO mutant

2.4 G97E突變體的酶學性質

為了探究突變位點Gly97Glu對突變體G97E酶學性質的影響，對G97E及野生型(WT)PRO的酶學性質進行了測定，結果如圖4與圖5所示．

圖4 pH對野生型PRO和G97E酶學性質的影響 Fig. 4 Effect of pH on the properties of wild-type PRO and G97E

與野生型PRO相似，G97E突變體最適pH為10.0，在pH 7～12的范圍內，G97E與野生型PRO的相對酶活力無明顯差異(圖4(a))．由圖4(b)可知，在pH 7～11和40℃條件下保溫20h后，G97E的殘余酶活力為初始酶活力的46%、69%、79%、86%和61%，而野生型PRO保留了初始酶活力的48%、67%、79%、85%和63%．野生型PRO和G97E的殘余酶活力差異不明顯，表明突變位點Gly97Glu對于G97E的最適pH及pH穩定性的影響不顯著．

圖5 溫度對野生型PRO和G97E酶學性質的影響 Fig. 5 Effect of temperature on the properties of wildtype PRO and G97E

由圖5(a)可知，G97E和野生型PRO的最適溫度約為60℃，在30～80℃范圍內，G97E與野生型PRO的相對酶活力無明顯差異．由圖5(b)可知，在20、30、40、50℃和60℃以及pH 10.0條件下保溫20h后，G97E的殘余酶活力分別為96%、94%、83%、72%和40%，而野生型PRO的殘余酶活力分別為95%、92%、85%、75%和42%．野生型PRO和G97E的殘余酶活力差異不明顯，表明突變位點Gly97Glu對于G97E的最適溫度及熱穩定性的影響不顯著．

3 結 論

運用HotSpot Wizard 3.0構建了克勞氏芽胞桿菌來源的堿性蛋白酶的突變庫，經篩選得到了堿性蛋白酶活力和膠原蛋白降解活力分別為野生型PRO 91.97%和65.84%的G97E突變體．G97E在基本不損失蛋白酶活力的情況下，膠原蛋白降解活力顯著降低，在應用于皮革脫毛時能夠降低皮革中膠原蛋白的損傷，從而為其在皮革工業的應用奠定了基礎．此外，G97E突變體的溫度穩定性和pH穩定性均沒有降低，使其在工業應用時能夠在較長的時間內保持酶活力，進一步提高了其在皮革工業中的應用價值．