多糖鐵復(fù)合物膠囊在模擬人體環(huán)境下的降磷效果研究

仇立志，王京端，王海燕

(上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國(guó)風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，山東 青島 266510)

高磷血癥是導(dǎo)致終末期腎臟病患者多器官功能損傷的關(guān)鍵因素[1]，因此降磷治療對(duì)患者血磷水平達(dá)標(biāo)非常重要。目前，臨床上常用的磷結(jié)合劑分為傳統(tǒng)型磷結(jié)合劑和新型磷結(jié)合劑[2]。其中，傳統(tǒng)型磷結(jié)合劑以含鋁、鈣成分為主[3]，但由于副作用較大[4]，臨床使用量逐年減少。新型磷結(jié)合劑以碳酸鑭、司維拉姆、PA21和檸檬酸鐵等[5-8]為主，其降磷效果明顯，副作用相對(duì)較少，偶有胃腸道不良反應(yīng)[9],但是價(jià)格昂貴。最新獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市的檸檬酸鐵片不僅可用于非透析慢性腎臟病缺鐵性貧血的治療[10-11]，而且可用于慢性腎病透析患者的高磷血癥治療。該品種的上市，為含鐵類(lèi)化合物的降磷研究提供了較好的指導(dǎo)意義。多糖鐵復(fù)合物膠囊在臨床上主要是用于妊娠期婦女缺鐵性貧血的治療[12]，具有含鐵量高、療效好、副作用小、配合物穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[13]。本試驗(yàn)研究了多糖鐵復(fù)合物膠囊在體外的降磷效果，并與其他磷結(jié)合劑進(jìn)行了體外降磷效果對(duì)比，為后續(xù)開(kāi)展相關(guān)臨床研究提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 多糖鐵復(fù)合物膠囊(上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國(guó)風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：160401)；復(fù)方氫氧化鋁片(青島黃海制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：1509211)；碳酸鈣D3片(北京康遠(yuǎn)制藥有限公司，批號(hào)：20151255)；司維拉姆片(美國(guó)Genzyme生物制藥公司，B5320B01)；碳酸鑭咀嚼片(英國(guó)HamolLimited，BJ408)；硫酸(新天化工試劑廠，分析純)；鹽酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)；抗壞血酸(天津市科威化學(xué)試劑有限公司，分析純)；鉬酸銨(上海銀典化工有限公司，分析純)；酒石酸銻氧鉀(天津廣成化學(xué)試劑有限公司，分析純)；磷酸二氫鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；水(娃哈哈純凈水)等。

1.2 儀器設(shè)備 Shimadzu島津UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；JJ-4S六聯(lián)數(shù)顯恒溫水浴電動(dòng)攪拌器(常州國(guó)宇儀器制造有限公司)；Mettler Toledo(梅特勒-托利多) ML204型電子分析天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]；H1650-W醫(yī)用離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 多糖鐵復(fù)合物膠囊磷結(jié)合過(guò)程中影響因素考察

1.3.1.1 時(shí)間因素影響 將多糖鐵復(fù)合物膠囊加入模擬胃液(pH 1.2)配制的KH2PO4的溶液中，水浴加熱，每隔10、30、60、90和120 min取少量反應(yīng)液于1.5 mL離心管中，離心，取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，用純化水定容。按鉬銻抗法按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的試驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算磷結(jié)合率。

1.3.1.2 溫度因素影響 將多糖鐵復(fù)合物膠囊加入模擬胃液(pH 1.2)配制的KH2PO4的溶液中,選取25、37和45 ℃[14]3個(gè)條件下反應(yīng)一定時(shí)間，取少量反應(yīng)液于1.5 mL離心管中，離心，取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，用純化水定容。按鉬銻抗法按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的試驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算磷結(jié)合率。

1.3.1.3 pH因素影響 將多糖鐵復(fù)合物膠囊加入KH2PO4的溶液中，調(diào)pH分別為1.2、3.0、5.0和8.0，水浴加熱，反應(yīng)120 min，取少量反應(yīng)液于1.5 mL離心管中，離心，取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，用純化水定容。按鉬銻抗法按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的試驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算磷結(jié)合率。

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選多糖鐵復(fù)合物膠囊降磷條件 將一定量的多糖鐵復(fù)合物膠囊加入KH2PO4水溶液中，調(diào)pH，水浴加熱，反應(yīng)一定時(shí)間[15]，取少量反應(yīng)液于離心管中，在轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1的高速離心機(jī)中離心，取上清液配制供試品。之后按鉬銻抗法[16]按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的試驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算磷結(jié)合率。

磷結(jié)合率=(反應(yīng)前測(cè)定量-反應(yīng)后測(cè)定量)/反應(yīng)前測(cè)定量×100%

采用時(shí)間(A)、溫度(B)和pH值(C)3個(gè)因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行L934正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

1.3.3 降磷效果評(píng)價(jià)方法

1.3.3.1 溶液的配制 硫酸溶液：量取50 mL濃硫酸(ρ為1.84 cm-3)，緩慢倒入50 mL純化水中，混均，備用。

10%抗壞血酸溶液：稱(chēng)取10.0 g抗壞血酸，用純化水溶解，并稀釋至100 mL，最后貯存于棕色玻璃瓶中。

鉬酸鹽溶液：稱(chēng)取13.0 g鉬酸銨溶解于100 mL純化水中。稱(chēng)取0.35 g酒石酸銻氧鉀溶解于100 mL純化水中。之后將鉬酸銨溶液緩慢地加入300 mL硫酸溶液中，邊加邊攪拌，再將100 mL酒石酸銻氧鉀溶液一并加入，最終混合均勻，貯存于棕色瓶中，并在4 ℃下保存。

磷酸鹽儲(chǔ)備溶液：先將磷酸二氫鉀在110 ℃條件下干燥2 h，并在干燥器中冷卻至室溫。稱(chēng)取0.219 7 g磷酸二氫鉀于1 000 mL容量瓶中，并用純化水溶解，之后滴加5 mL硫酸溶液，混勻，最終用純化水定容至標(biāo)線。此儲(chǔ)備溶液相當(dāng)于含磷50.0 μg·mL-1。

磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液：量取5.00 mL磷酸鹽儲(chǔ)備溶液，移入50 mL容量瓶中，用純化水定容至標(biāo)線。稀釋后的溶液相當(dāng)于含磷5.00 μg·mL-1。

1.3.3.2 模擬體液的配制 模擬胃液的配制：將5 mL的HCl加入500 mL純化水中，調(diào)節(jié)至pH=1.2。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，加入10 mL純化水稀釋?zhuān)偌尤?.0 mL 10%抗壞血酸溶液，混勻。30 min后再加入2 mL鉬酸鹽溶液，充分混勻，放置60 min；采用分光光度法測(cè)定并繪制曲線。

1.4 多糖鐵復(fù)合物膠囊降磷效果考察 取不同量的多糖鐵復(fù)合物膠囊按“1.3.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行磷結(jié)合，之后按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的試驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算磷結(jié)合率。

1.5 不同磷結(jié)合劑降磷效果的比較 分別稱(chēng)取一定量的復(fù)方氫氧化鋁片、碳酸鈣D3片、司維拉姆片、碳酸鑭咀嚼片加入模擬胃液配置的磷酸二氫鉀的溶液中，用鉬銻抗法測(cè)定，計(jì)算磷結(jié)合率。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 本試驗(yàn)所采用的鉬銻抗法要求磷元素的濃度在小于1.2 μg·mL-1，這樣得出的結(jié)果在0～1.2 μg·mL-1區(qū)間內(nèi)有很好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.711 3X-0.041，R2=0.990 3。

2.2 多糖鐵復(fù)合物膠囊磷結(jié)合過(guò)程中影響因素考察結(jié)果

2.2.1 時(shí)間影響 多糖鐵與磷酸鹽的結(jié)合效果是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。這是由于多糖鐵與磷酸鹽在酸性介質(zhì)里接觸時(shí)間越長(zhǎng)，利用多糖鐵中鐵離子的解離，從而導(dǎo)致磷結(jié)合率升高，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 時(shí)間對(duì)多糖鐵復(fù)合物膠囊磷結(jié)合的影響

2.2.2 溫度影響 多糖鐵與磷酸鹽的結(jié)合效果隨著介質(zhì)溫度升高而降磷效果明顯。這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，溫度升高會(huì)加快多糖鐵中鐵離子的解離，且與磷酸鹽快速反應(yīng)，致使磷結(jié)合率升高。但是考慮人體環(huán)境的特殊性，溫度不能超過(guò)37 ℃，所以，最終選界定溫度為37 ℃，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 溫度對(duì)多糖鐵復(fù)合物膠囊磷結(jié)合的影響

2.2.3 pH影響 介質(zhì)pH值會(huì)影響多糖鐵與磷酸鹽的結(jié)合效果。在pH值低的情況下多糖鐵與磷酸鹽具有明顯的結(jié)合效果；隨著pH值升高，多糖鐵與磷酸鹽結(jié)合率明顯降低，主要原因是pH值太高抑制鐵離子解離從而影響多糖鐵溶解度，致使鐵離子與磷酸鹽結(jié)合率降低，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 pH值對(duì)多糖鐵復(fù)合物膠囊磷結(jié)合的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 由方差分析可知，多糖鐵復(fù)合物膠囊在模擬人體環(huán)境下降磷效果研究中，因素C的影響差異具有顯著性，各因素對(duì)磷酸鹽結(jié)合率影響順序?yàn)镃>B>A，與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致，即pH值對(duì)磷結(jié)合率影響較大，其次是溫度和時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表5～6。所以，多糖鐵復(fù)合物膠囊在模擬人體環(huán)境下降磷最佳方法是C2B2A3，即pH值為3.0，水浴37 ℃，反應(yīng)120 min。

表6 正交試驗(yàn)方差分析

2.4 多糖鐵復(fù)合物膠囊降磷效果考察 為考察多糖鐵復(fù)合物膠囊降磷效果，將不同劑量的多糖鐵復(fù)合物膠囊在正交試驗(yàn)優(yōu)選的條件下開(kāi)展降磷效果研究，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 不同劑量的多糖鐵復(fù)合物膠囊磷結(jié)合率

2.5 多糖鐵復(fù)合物膠囊與磷結(jié)合劑降磷效果的比較 為考察多糖鐵復(fù)合物膠囊與不同磷結(jié)合劑之間的降磷效果，在同一劑量及條件下，將多糖鐵復(fù)合物膠囊與磷結(jié)合劑在正交試驗(yàn)優(yōu)選的條件下開(kāi)展研究，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 多糖鐵復(fù)合物膠囊與磷結(jié)合劑降磷效果比較

3 討論

本試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕悄M人體消化道內(nèi)酸堿條件，諸如消化酶、膽汁和氯化鈉等并未含在模擬條件中[17]。通過(guò)影響因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果提示，多糖鐵復(fù)合物膠囊在磷酸鹽結(jié)合過(guò)程中，磷結(jié)合率主要受pH值影響。當(dāng)pH 1.2～5時(shí)，多糖鐵復(fù)合物膠囊有較強(qiáng)的磷結(jié)合能力，尤其是pH為3時(shí)，磷結(jié)合能力最強(qiáng)；當(dāng)pH為弱堿性時(shí)，磷結(jié)合能力較弱。這表明多糖鐵復(fù)合物膠囊在胃或十二指腸和空腸均能與磷酸鹽結(jié)合，且在胃環(huán)境內(nèi)磷結(jié)合效果最佳。

目前，臨床上使用的磷結(jié)合劑有碳酸鈣片、氫氧化鋁片[3]、司維拉姆片[6]以及碳酸鑭咀嚼片[5]等，由于他們具有較強(qiáng)的磷結(jié)合能力，是目前治療高磷血癥的首選藥物。為了評(píng)估多糖鐵復(fù)合物膠囊的降磷效果，將多糖鐵復(fù)合物膠囊與不同磷結(jié)合劑進(jìn)行比較，在相同條件和劑量下多糖鐵復(fù)合物膠囊降磷效果優(yōu)于復(fù)方氫氧化鋁片、碳酸鑭咀嚼片(P<0.01)和碳酸鈣片(P<0.05)，但略差于司維拉姆片(P<0.01)。

本試驗(yàn)多糖鐵復(fù)合物膠囊在模擬人體環(huán)境下的降磷效果研究中，多糖鐵復(fù)合物膠囊可以明顯地降低磷酸鹽含量，且與劑量呈正相關(guān)性，隨著劑量的增加，降磷效果越好。當(dāng)多糖鐵復(fù)合物膠囊的劑量(以鐵計(jì))為3 000 mg時(shí)，磷結(jié)合率高達(dá)80.01%。所以，將多糖鐵復(fù)合物膠囊開(kāi)發(fā)成含鐵磷結(jié)合劑，既可以補(bǔ)鐵補(bǔ)血又可以降低磷酸鹽，且副作用少，將具有良好的應(yīng)用前景。