比較甲基化Sept9與其他標志物對結直腸癌診斷價值的meta分析

鄧翰林，張劍波，顧海濤，王繼見

(重慶醫科大學附屬第二醫院胃腸肛腸外科，重慶 400010)

0 引言

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是全球第三常見的惡性腫瘤，其預后與診斷的分期高度相關[1]。因此，盡早診斷結直腸癌是提高患者生存率及減輕社會經濟負擔的關鍵。目前較常見的用于CRC篩查的無創方法是糞便潛血試驗(fecal occult blood test，FOBT)和癌胚抗原(CEA)檢測。然而，這些方法的靈敏度及特異度相對不足，在一定程度上限制了其在CRC篩查中的應用。結腸鏡檢測是CRC篩查的有效方式，具有非常高的診斷價值，但其是一種侵入性檢查，需要腸道準備，侵犯了患者的隱私，依從性低，會給病人帶來潛在的風險，并且不利于CRC的廣泛篩查。因此需要一種較高靈敏度和特異度的、更少侵襲性的、幾乎不需要準備的、患者易接受的可供選擇的方式篩查CRC。

DNA甲基化是CRC中研究最廣泛的表觀遺傳學過程之一，CRC特異性甲基化基因的研究為開發生物標志物提供了各種新的機遇[2]。在大腸癌發生過程中，Septin9基因V2轉錄物啟動子區的CpG島3高甲基化，并且該基因的DNA從壞死和凋亡的癌細胞釋放到外周循環血中[3]。基于外周血的甲基化Septin9(methylated Sept9，mSept9)檢測旨在檢測從CRC細胞釋放到外周血的Septin9基因DNA啟動子區域的異常甲基化[4]。因此，通過檢測外周血中Septin9基因特異性啟動子區域的DNA甲基化程度，可以評估患結直腸癌的風險。

近年報道，血漿mSept9的靈敏度和特異度在不同研究中差異較大，靈敏度在0.51到0.93之間，特異度在0.62到0.94之間[5-8]。有研究表明，血漿mSept9檢測在癥狀人群中的診斷性可能優于CEA和糞便免疫化學試驗[9]。血漿mSept9聯合FOBT與單獨檢測mSept9相比，可能具有更好的診斷表現[10]。血漿mSept9聯合其他標志物是CRC篩查的新趨勢，在本meta分析中，我們對血漿mSept9的診斷性能進行評估，并且將血漿mSept9與血清CEA、糞便免疫化學試驗(The fecal immunochemical test，FIT)或免疫化學糞便潛血試驗(immunochemical fecal occult blood test，iFOBT)、mSept9 聯合CEA、mSept9聯合Fit/iFOBT進行診斷準確性比較，探究血漿mSept9聯合CEA或Fit/iFOBT在CRC診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

以 PubMed、Embase、Cochrane Library、Web of Science、中國基礎設施工程(CNKI)數據庫收錄的關于比較甲基化Sept9與其他標志物對結直腸癌診斷價值的研究作為研究對象。

1.2 方法

1.2.1 檢索策略

本meta分析以系統評價和薈萃分析優先報告條目(PRISMA)為指導進行。兩位研究人員獨立對數據庫進行檢索。中文檢索詞：結直腸癌、甲基化、septin9、sept9、癌胚抗原、糞便潛血試驗；英文檢索詞：methylated、msept9、mseptin9、carcinoembryonic antigen、fecal occult blood test、colorectal cancer。文獻檢索日期截至2020年1月。

1.2.2 納入和排除標準

納入標準：(1)結直腸癌由病理確診；(2)同時分析外周血血漿mSept9、mSept9聯合CEA或者FOBT對大腸癌的診斷價值；(3)研究數據完整，可用于構建2×2表格；(4)包括由良性疾病或健康個體組成的對照組；(5)英文或中文全文文章。排除標準：(1)重復發表；(2)樣本小于30；(3)會議論文摘要，綜述，案例報告，動物實驗等。

1.2.3 文獻篩選與數據提取

由兩名研究者獨立篩選文獻、采用標準化表格提取資料并交叉核對，如有分歧，則共同討論或由第三方協商解決。提取的數據包括：第一作者姓名、發表年份、研究地區、研究類型、患者平均年齡與性別、檢測試劑盒、真陽性病例數(truepositives，TP)、假陽性病例數(falsepositives，FP)、假陰性病例數(falsenegatives，FN)、真陰性病例數 (truenegatives，TN)等。

1.2.4 納入文獻的質量評價

按照診斷性試驗質量評價(Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies-2，QUADAS-2)評估納入文章的方法學質量。QUADAS-2包括病例選擇，待評價試驗，金標準，病例流程和進展情況四個部分。最后，使用Review Manager 5.3軟件對納入文章的偏倚風險進行評估，并繪制偏倚風險圖。

1.3 統計學處理和分析

采用雙變量混合效應模型，匯總敏感度、特異度、陽性似然比、陰性似然比和診斷比值比并與95%可信區間(95%confidenceintervals，CI)相結合，同時繪制森林圖和綜合受試者工作特征曲線(summary receiver operating characteristic，SROC)，利 用 曲 線 下 面 積 (the area under the curve，AUC)來量化診斷試驗的準確性。為檢測閾值效應，采用Spearman相關系數評價靈敏度與特異度的關系。如果Spearman相關系數的P值大于0.6，則認為異質性是由閾值定義的差異引起[11]。用Q檢驗和I2檢驗評估研究的異質性，若I2大于50%為則認為存在顯著異質性，并采用回歸分析和敏感性分析探究潛在的異質性來源。通過Deek’s漏斗圖評估潛在的發表偏倚[12]。所有統計分析均采用Stata SE 15.0軟件進行。

2 結果

2.1 文獻檢索結果

通過初步檢索，共獲得529篇文獻，去除重復文獻207篇，然后通過閱讀標題及摘要，去除綜述、meta分析、信件、非臨床研究等文獻260篇，再閱讀全文，去除非診斷性研究、樣本量小于30、未涉及mSept9與其他試驗相結合文獻33篇，進一步刪除不能獲得完整統計數據的文獻18篇，最后共有10篇文獻納入本meta分析。

2.2 文獻質量評價

QUADAS-2用于評估納入研究的方法學質量，結果見圖1。6項的研究是回顧性的，只有2項研究指明患者是隨機或是連續的，因此，余下研究的患者選擇項被標記為不確定。大部分研究采用了病例對照并且沒有避免不恰當的排除。一半的研究未指明待評價試驗是否使用盲法。

2.3 納入文獻的基本特征

納入的10項研究[8，13-21]中，共包括734名CRC患者，均經病理確診。5項研究[8，13-16]評估了 mSept9、FIT/iFOBT及mSept9聯合FIT/iFOBT對CRC的診斷效能。5項研究[17-21]評估了mSept9、CEA及mSept9聯合CEA對CRC的診斷效能。有4項前瞻性研究[8,13,16,19]，6項病例對照研究[14,15,17,18,20,21]。納入文獻的基本特點見表1。

2.4 META分析結果

2.4.1 mSept9的診斷效能

10項研究[8，13-21]分析了單獨檢測mSept9對結直腸癌的診斷價值，其合并靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、診斷比值比分別為 0.70(95%CI：0.63～0.76)、0.93(95%CI：0.86～0.97)、10.7(95%CI：4.9～23.2)、0.32(95%CI：0.26～0.40)、33(95%CI：14～77)。SROC 曲線下面積 (AUC)為：0.84(95%CI：0.81～0.87)。靈敏度及特異度的森林圖和SROC曲線見圖2AB。

2.4.2 不同診斷方式的比較

5 項 研 究[8，13-16]直 接 比 較 了 mSept9、FIT/iFOBT 和mSept9聯合FIT/iFOBT的診斷效能，其合并靈敏度、合并特異度及AUC見表2。通過曲線下面積AUC量化診斷試驗的準確性，mSept9、FIT/iFOBT和mSept9聯合FIT/iFOBT的AUC 分別為 0.87(95%CI：0.84～0.90)、0.86(95%CI：0.82～0.89)、0.93(95%CI：0.91～0.95)，因此，mSept9 聯合 FIT/iFOBT 的診斷效能優于mSept9，而mSept9與FIT/iFOBT的診斷效能相當。

表1 比較mSept9與其他標志物對結直腸癌診斷價值的meta分析納入文獻的基本特征

表2 比較mSept9、FIT/iFOBT和mSept9聯合FIT/iFOBT的診斷效能

表3 比較mSept9、CEA和mSept9聯合CEA的診斷效能

表4 納入研究不同臨床因素回歸分析結果

5項研究[17-21]直接比較了mSept9、CEA和mSept9聯合CEA的診斷效能，其合并靈敏度、合并特異度及AUC見表3。通過曲線下面積AUC量化診斷試驗的準確性，mSept9、CEA和mSept9聯 合 CEA 的 AUC 分 別 為 0.76(95%CI：0.72～0.79)、0.61(95%CI：0.57～0.65)、0.85(95%CI：0.81～0.87)，因此，mSept9 聯合 CEA 的診斷效能優于mSept9，同時mSept9的診斷效能優于CEA。

2.5 異質性來源的探討

mSept9的合并敏感度(I2=75.85，P＜0.001)及特異度(I2=87.42，P＜0.001)均存在顯著異質性。Spearman相關系數為0.23(P=0.52)，表明異質性不是由閾值定義的差異引起。使用Deek's漏斗圖評估納入文獻不存在發表偏移(P=0.68)，結果見圖2C。我們通過單獨移除每個研究，然后再次計算匯總統計數據的方式進行敏感性分析，然而沒有發現單個研究對整體有明顯的影響，敏感性分析表明結果穩健。最后，我們根據納入研究的研究類型、樣本量、聯合檢測及試劑盒，進行meta回歸分析探究潛在的異質性來源，結果見表4。我們發現研究樣本量(P=0.01)及聯合檢測(P=0.02)是敏感度異質性的主要來源，使用的試劑盒(P=0.03)是特異度異質性的主要來源。

3 討論

通過系統的文獻檢索，嚴格的篩選和分析，我們發現血漿mSept9在CRC的診斷中具有中等的靈敏度(0.7)及較高的特異度(0.93)。盡管mSept9聯合其他標志物后，其特異度會相對降低，具體結果見表2與表3，但本研究發現血漿mSept9聯合FIT/iFOBT和血漿mSept9聯合CEA的診斷準確性均優于血漿mSept9單獨檢測。同時，我們還發現血漿mSept9的診斷準確性優于CEA，而血漿mSept9的診斷準確性與FIT/iFOBT無顯著差異。FIT/iFOBT的合并敏感度及特異度與之前發表的研究有所差異[22]，可能是因為糞便潛血試驗有兩種檢測方式，即化學法檢測糞便潛血及免疫法檢測糞便潛血，本meta分析納入的研究僅采用免疫法檢測糞便潛血，同時本meta分析納入的研究較少也可能導致差異。

近年來，血漿mSept9已被用于CRC的非侵入性篩查，已有meta分析報告了血漿mSept9聯合Fit的診斷價值[10,23]，但其納入的研究較少，同時報告直接比較mSept9聯合FOBT與單獨檢測msept9的meta分析也較少。此外，評估血漿mSept9聯合CEA診斷CRC的meta分析幾乎未見報道。血漿mSept9聯合其他標志物是提高CRC檢出率的有效策略。CEA檢測已非常成熟，在結直腸癌的診斷、治療及隨訪中占有重要的地位。糞便潛血試驗是臨床結直腸癌篩查成本最低、最常用的檢測方式，但部分人認為談論、收集和儲存糞便樣本是不愉快的和尷尬的。一項研究表明，94%的拒絕行FIT的平均風險患者選擇了血漿mSept9[24]。同時，德國的一項研究表明，97%的拒絕結腸鏡檢查的人接受了無創篩查，其中83%的人選擇了血漿mSept9[25]。所以血液檢測可能更有吸引力，從而導致更高的參與度，即血漿mSept9聯合CEA與血漿mSept9聯合FIT/iFOBT相比，前者可能更易被人接受。

雖然我們的敏感性分析證實了meta分析結果是穩健的，但不可否認的是我們的研究存在顯著的異質性。Spearman相關系數分析表明本研究的異質性不是由閾值定義的差異所造成的。所以我們采用了meta回歸分析探究潛在性的異質性來源，meta回歸分析提示受試者樣本量、聯合檢測、使用的試劑盒是異質性的潛在來源。本次納入的研究，有4項研究樣本量小于150，樣本量較小。本次研究使用的試劑盒分為兩類，一類Epi proColon試劑盒，另一類為非Epi proColon試劑盒。而EPI proColon試劑盒本身有兩代檢測方法和三種算法，而非Epi proColon試劑盒我們不能進一步的其詳細信息。

本研究存在一些不足：納入的研究相對較少，并且大部分為小樣本研究；納入的大部分受試者都來自中國的醫院，無法進一步探索mSept9對世界不同地區人群在腫瘤行為方面可能存在的生物學差異；只評估了mSept9對結直腸癌的診斷價值，忽略了其對癌前病變的診斷作用；不能明確非EpiproColon試劑盒具體為何種試劑盒，無法探討哪種試劑盒的診斷性能最好，以及不同試劑盒對診斷性能的影響；本meta分析不包括除中文和英文以外的任何語言，語言限制可能導致潛在的發表偏倚風險；大多數研究為病例對照研究，排除了“難診斷”的患者，這可能會導致患者選擇偏倚和對診斷準確性的過高估計。

綜上所訴，血漿mSept9在CRC的診斷中表現出良好的診斷性能。mSept9的診斷效能可能與FIT/iFOBT相似，而mSept9的診斷效能優于CEA。與mSept9相比，mSept9聯合FIT/iFOBT或CEA具有更高的診斷準確性，可以更有效地診斷結直腸癌，這為結直腸癌的篩查提供了新的選擇。