基于HPLC-ELSD法不同企業(yè)清熱解毒口服液中山銀花違規(guī)投料的研究與篩查

朱偉堃，王中如，牛紅霞，周欣

(菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000)

0 引言

清熱解毒口服液由石膏、金銀花、玄參等十二味中藥組成[1]，現(xiàn)收載于《中國藥典》2015年版一部。具清熱解毒之功效，用于熱毒壅盛所致的發(fā)熱面赤、煩躁口渴、咽喉腫痛；流感、上呼吸道感染見上述證候者。清熱解毒口服液生產廠家眾多，據(jù)統(tǒng)計，目前全國有211家生產企業(yè)。

清熱解毒口服液方中所用金銀花量較大，為134g每1000mL，與其同科植物山銀花，兩者長期混用[2,3]。《中國藥典》2005年版一部按照“一物一名”的原則將金銀花和山銀花明確區(qū)分為兩個品種[4]。兩者雖為近緣植物，但藥效與安全性不能一概而論[5-7]，李文沛等[8]發(fā)現(xiàn)與金銀花相比，高劑量山銀花灰氈毛忍冬會導致大鼠過敏。近年來，山銀花產量大價格低，而金銀花產量低價格高[9,10]，造成兩者在市場中混用的情況無法得到解決。價格的差異，可能會導致部分生產企業(yè)存在為降低成本而不按處方進行投料的行為。兩者在藥材時相對較好區(qū)分[11]，但制成制劑后由于缺少方法，難以進行區(qū)別。

本文以山銀花的特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙[12,13]為指標，建立了清熱解毒口服液中山銀花的篩查方法。筆者收集到了全國16家生產企業(yè)的42批次樣品，來自全國8個省份。通過建立的方法來評價和篩查各生產企業(yè)以山銀花摻混金銀花違規(guī)投料的情況。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜儀-蒸發(fā)光散射檢測器(安捷倫科技有限公司)，超聲波清洗器(杭州超聲波有限公司)，十萬分之一電子天平(XS105型，METTLER TOLEDO)，超純水儀(默克密理博)。

1.2 試藥

灰氈毛忍冬皂苷乙對照品(批號：111814-201604，含量以94.4%計)、金銀花對照藥材(批號：121060-201608)、山銀花對照藥材(批號：121595-201202)均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇(色譜純，默克公司)、乙腈(色譜純，默克公司)、D101型大孔吸附樹脂(國藥集團化學試劑有限公司)

清熱解毒口服液樣品來自2020年山東省內市場流通抽樣，具體樣品收集情況見表1。

表1 樣品收集情況

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18色譜柱 (4.6×250mm，5μm)，柱溫：30℃，流速1.0mL/min以乙腈為流動相A，水為流動相B，按表2進行梯度洗脫。

表2 梯度洗脫表

蒸發(fā)光散射檢測器檢測，漂移管溫度為60℃，霧化室溫度 50℃，氣體流速為 1.6L/min，進樣量：對照品 5、20μl，供試品溶液 10μl。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品10.26mg置50mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1mL含灰氈毛忍冬皂苷乙0.1937mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品10mL，加在D101型大孔吸附樹脂柱(內徑為1.0cm，柱高為20cm)上，用水100mL洗脫，棄去水液，再用甲醇100mL洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶解至干(溫度低于60℃)，殘渣加50%甲醇溶解，轉移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖1 典型液相色譜圖

表3 樣品測定結果

2.4 專屬性試驗

2.4.1 對照藥材溶液的制備

分別稱取金銀花和山銀花對照藥材粉末0.5g，精密稱定，置50mL量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處30min，放冷，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為金銀花和山銀花對照藥材溶液。

2.4.2 山銀花陰性模擬樣品溶液的制備

取處方中所有藥味，按處方比例制成缺山銀花的陰性對照樣品，按供試品溶液的制備方法，制成山銀花陰性對照溶液。

2.4.3 山銀花陽性模擬樣品溶液的制備

取山銀花替代金銀花，處方中其他藥味按處方比例，制成山銀花陽性對照品，按供試品溶液的制備方法，制成山銀花陽性對照溶液。

取上述金銀花和山銀花對照藥材溶液、山銀花陰性和陽性模擬樣品溶液及“2.2”項下對照品溶液進行測定，結果顯示金銀花對照藥材和山銀花陰性模擬樣品在與灰氈毛忍冬皂苷乙對照品色譜峰相應的位置上未出現(xiàn)保留時間一致的色譜峰，表明制劑中處方的藥味及輔料對檢測結果無干擾。典型圖譜見圖1。

2.5 檢測限和定量限

精密量取對照品溶液，逐級稀釋后注入液相色譜儀測定，以信噪比S/N=3時，此時的濃度為檢測限；以S/N=10時，此時的濃度為定量限。灰氈毛忍冬皂苷乙的檢測限為0.0194mg/mL，定量限為0.0388 mg/mL。

2.6 線性關系考察

精密吸取 2.1.2 項下對照品溶液各 3、5、10、15、20μl，注入液相色譜儀，分別測定峰面積。以灰氈毛忍冬皂苷乙進樣量的自然對數(shù)為橫坐標，峰面積的自然對數(shù)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=1.253X+3.674，R2=0.999。灰氈毛忍冬皂苷乙進樣量在0.5811-3.8740μg之間，其自然對數(shù)與峰面積積分值自然對數(shù)呈良好的線性關系。

2.7 儀器精密度試驗

精密吸取2.1.2項下對照品溶液20μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，取灰氈毛忍冬皂苷乙峰面積的自然對數(shù)，RSD為0.52%，表明儀器精密度良好。

2.8 耐用性試驗

取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，用Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)、Thermo C18(250mm×4.6mm，5μm)兩種色譜柱試驗，結果一致。

2.9 樣品測定

根據(jù)灰氈毛忍冬皂苷乙的檢測限(0.0194mg/mL)，故建議規(guī)定清熱解毒口服液樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙的含量不得過0.025mg/mL。按照上述建立的方法對抽檢的42批次清熱解毒口服液進行檢測，有2家企業(yè)的4批次樣品檢出灰氈毛忍冬皂苷乙，且均超出定量限，具體結果統(tǒng)計見表3，檢出灰氈毛忍冬皂苷乙樣品的典型色譜圖見圖1(F)。

3 討論

3.1 檢測條件的篩選

樣品處理時查閱有關文獻[14-15]，考察了直接稀釋進樣、正丁醇萃取、D101型大孔吸附樹脂除雜等提取方法。直接稀釋進樣時目標峰附近雜峰較多，對于結果無法做出很好判斷；正丁醇萃取時易發(fā)生乳化，且正丁醇萃取液減壓干燥時間較長，不適合大批量處理。而大孔吸附樹脂處理，可克服上述兩種處理方法存在的困難。在流動相選擇時，考察了乙腈-水，乙腈-0.4%冰醋酸溶液，乙腈-0.1%磷酸溶液等，最終選擇了乙腈-水作為流動相，使得目標峰與鄰近雜峰分離較好。

3.2 樣品測定

通過上述測定結果可知，有2家企業(yè)的4批次樣品檢出了山銀花特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙，檢出率9.5%，說明部分企業(yè)為降低成本，涉嫌以山銀花摻混金銀花進行違規(guī)投料，這對按處方進行投料的生產企業(yè)存在一定的不正當競爭。清熱解毒口服液中山銀花的違規(guī)使用問題仍不容樂觀，現(xiàn)行法定標準不能有效控制企業(yè)的違規(guī)投料行為，增加清熱解毒口服液中山銀花檢查項尤為必要。

最后，建議企業(yè)就山銀花違規(guī)投料問題行自檢，規(guī)范生產，并加強從業(yè)人員的有關培訓。建議增加清熱解毒口服液中山銀花的檢查項目，以提高產品的安全性。建議監(jiān)管部門加強對生產企業(yè)從原料到成品的檢查力度，提高企業(yè)的質量意識和質控水平，從而保障人民群眾的用藥安全。