基于網絡藥理學探討四逆湯防治阿霉素心臟毒性機制

盤冰潔，陸彩虹，謝巍，林彩霞，肖萍

（柳州市婦幼保健院，廣西科技大學附屬婦產，兒童醫(yī)院，廣西 柳州 545001）

0 引言

阿霉素（doxorubicin）是一種強效、廣譜的抗腫瘤藥，廣泛用于各種實體瘤和血液惡性腫瘤，但因其具有心臟毒性的副作用，使其在臨床上的應用受到限制[1,2]。阿霉素引起心臟毒性的機制相當復雜，如氧化應激損傷[3]、細胞自噬[4]、細胞凋亡[5]等，因此使用單一作用靶點的心臟保護劑（如B受體阻斷劑、鈣通道阻斷劑）并沒有取得很好的保護心臟作用。中藥具有多成分、多靶點、系統調控的優(yōu)勢，在防治阿霉素引起的心臟毒性中取得一定的臨床療效[6,7]。

四逆湯是張仲景《傷寒論》中經典的回陽救逆方，由附子、生姜和甘草組成，在心血管疾病、抗休克、抗腫瘤等疾病均有療效。近年來研究發(fā)現，四逆湯在防治阿霉素心臟毒性中取得較好的療效[8-10]，但具體機制尚未闡明。網絡藥理學是運用計算機技術構建藥物-疾病-靶點網絡關系，實現闡明中藥多成分、多靶點、多通路的分析[11]。因此，本文應用網絡藥理學方法，以探討四逆湯防治阿霉素心臟毒性的藥理學機制。首先收集四逆湯的有效成分并預測作用靶點，并收集阿霉素心臟毒性的靶點；然后取兩者的共同靶點進行互作關系分析，以獲取關鍵靶標；最后對共同靶點進行基因本體和通路富集分析，篩選出藥物作用的生物學過程、分子功能、細胞組分以及信號通路，闡明四逆湯防治阿霉素心臟毒性的機制，為進一步研究提供線索，具體研究流程見圖1。

圖1 研究流程圖

1 資料與方法

1.1 四逆湯有效成分的篩選及靶點的預測

利用中藥系統藥理學數據庫（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）收集四逆湯中附子、甘草、生姜的化學成分，設定參數口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性指數（drug-like index，DL）≥0.18篩選出四逆湯的有效成分。

1.2 四逆湯作用靶點和阿霉素心臟毒性靶點的收集

利用TCMSP平臺檢索四逆湯有效成分的潛在靶點。通過蛋白質數據庫( Uniprot Database，https://www.uniprot.org/)篩選出物種為“人”的靶點，剔除重復后獲得四逆湯有效成分的靶點蛋白信息。

運 用Genecards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://www.omim.org/）數 據 庫，以“doxorubicin-induced cardiotoxicity”或“adriamycin-induced cardiotoxicity”為關鍵詞，收集阿霉素心臟毒性的靶點信息。

將四逆湯有效成分對應的靶點與阿霉素心臟毒性的靶點上傳至Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htmL）得到共同靶點，即四逆湯防治阿霉素心臟毒性的預測靶點。

1.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡的構建

將收集的四逆湯有效成分及共同靶點輸入Cytoscape 3.7.1 軟件中，構建四逆湯治療阿霉素心臟毒性的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。網絡圖中的點代表藥物成分或者靶點，邊代表藥物成分和靶點之間的相互作用。

1.4 靶點相互作用網絡的構建

將共同靶點導入STRING（http://string-db.org）平臺，選擇物種為“人”，獲得靶點相互作用網絡圖（PPI），并通過Cytoscape 3.7.1 軟件進行網絡分析，獲取度值為前20 的Hub 蛋白。

1.5 靶點GO富集和KEGG富集分析

采用David數據庫( https://david.ncifcrf.gov/)對靶點蛋白進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，以錯誤發(fā)現率（false discovery rate，FDR）＜0.05作為篩選條件，獲得四逆湯治療阿霉素心臟毒性的GO富集和KEGG富集結果，并通過R軟件對結果可視化。

2 結果

2.1 四逆湯有效成分及靶點篩選結果

根據OB≥30%，DL≥0.18篩選出四逆湯中附子的有效成分21個，對應靶點56個，其中有15個化合物未找到對應的靶點；甘草的有效成分92個，對應靶點238個，其中有4個化合物未找到對應的靶點；生姜的有效成分5個，對應靶點20個，其中有1個化合物未找到對應的靶點。通過 Uniprot蛋白質數據庫篩選出物種為“人”的靶點，剔除重復后共得四逆湯有效成分118個，靶點243個。

表1 四逆湯中成分和靶點

2.2 四逆湯防治阿霉素心臟毒性藥物-成分-靶點-疾病網絡

通過Genecards和OMIM數據庫共收集阿霉素致心臟毒性的靶標128個，將阿霉素心臟毒性的靶點與四逆湯的靶點進行比對，得共同靶點41個，見圖2。將41個共同靶點與四逆湯有效靶點比對，發(fā)現118個有效成分中有90個成分成功比對，說明四逆湯中28個有效成分沒有發(fā)揮保護阿霉素心臟毒性的作用。

將數據導入Cytoscape 3.7.1 軟件構建四逆湯治療阿霉素心臟毒性“藥物—成分—靶點—疾病”網絡圖，見圖3。圖中不同顏色代表不同的節(jié)點，黃色代表四逆湯，藍色代表四逆湯中的有效成分，紫色代表阿霉素心臟毒性，綠色代表共同靶點。由圖可知，四逆湯治療阿霉素心臟毒性呈現多成分、多靶點的特征。

圖2 藥物和疾病靶點韋恩圖

圖3 “藥物—成分—靶點—疾病”網絡圖

2.3 蛋白相互作用關系分析

將四逆湯防治阿霉素心臟毒性的41個共同靶點上傳至STRING 平臺，得各靶點之間的互作關系網絡圖，各靶點之間均存在相互作用，無游離靶點，見圖4。通過Cytoscape 軟件中的Cytohubba 插件獲取度值為前20的Hub蛋白，見圖5。

圖4 蛋白互作關系圖

圖5 四逆湯防治阿霉素心臟毒性的關鍵靶點

2.4 四逆湯治療阿霉素心臟毒性基因本體（GO）富集分析

為闡明四逆湯防治阿霉素心臟毒性靶點參與的生命過程，使用 DAVID 數據庫對41個共同靶點進行生物學過程（biological process，BP）、分 子 功 能（molecular function，MF）以及細胞組分（cellular component，CC） 富集分析，設置篩選條件為錯誤發(fā)現率（false discovery rate，FDR）＜0.05，共富集140個BP，10個CC和5個MF，部分生物學過程及細胞組分、分子功能，見圖6。由此可見，四逆湯治療阿霉素心臟毒性主要參與生物學過程為調節(jié)細胞凋亡、細胞程序性死亡、對非生物刺激的反應、對有機物和無機物的反應等多個過程；細胞組分包括細胞質、生物膜內環(huán)境、膜筏、細胞器腔等；分子功能包括蛋白質二聚化活性、酶結合、識別蛋白結合、抗氧化活性等多種功能。由此可以推測，四逆湯防治阿霉素心臟毒性是由多途徑協同作用。

圖6 GO富集分析

2.5 四逆湯治療阿霉素心臟毒性KEGG 通路富集分析

為進一步揭示四逆湯防治阿霉素心臟毒性的潛在作用機制，對41個共同靶點進行KEGG富集分析，依據FDR＜0.05共篩選得17條相關通路，見圖7。結果顯示多條通路，包括癌癥通路、胰腺癌、結腸癌、子宮內膜癌、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、非小細胞肺癌、膀胱癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、VEGF信號通路、 黏著斑、小細胞肺癌、ErbB信號通路、細胞凋亡、MAPK信號通路、神經營養(yǎng)因子信號通路。提示四逆湯通過以上多條通路來發(fā)揮防治阿霉素心臟毒性的作用。

圖7 GO富集分析

3 討論

鑒于阿霉素具有強大的抗腫瘤作用，越來越多的研究尋求減輕心臟毒性的方法，例如通過改變阿霉素的結構或制成脂質體制劑或者使用心臟保護劑[12](Octavia, Tocchetti et al.2012)，然而只有少部分制劑能進入臨床試驗，而最終能臨床使用則少之又少。中藥復方按照“君臣佐使”的原則配伍多種草藥或礦物，可以達到增效的目的，因此越來越得到研究者的青睞，例如參麥注射液、參芪扶正注射液、參附注射液、生脈注射液、炙甘草湯、生脈飲、四逆湯、益氣活血方、參芪注射液、復方苦參注射液等[13]。四逆湯具有回陽救逆功效，主治心腎陽衰寒厥證。研究證實，四逆湯具有強心利尿、抗休克、增加血流量的作用，可抵抗阿霉素心臟毒性引起的心輸出量不足、水鈉潴留等[14]。研究采用網絡藥理學方法研究四逆湯防治阿霉素心臟毒性的機制，有助于更好使用本處方。

四逆湯由附子、生姜、甘草三味藥組成?，F代藥理學研究表明，附子具有心肌保護的作用，其總生物堿可以調節(jié)缺血心肌能量代謝、細胞修復和抗氧化自由基等相關蛋白的表達[15]；干姜具有改善局部血液循環(huán)的作用，通過環(huán)氧合酶、脂氧合酶促進血管收縮反應[16]；甘草具有抗氧化、保護心肌細胞的作用，通過調控清除自由基、調節(jié)血脂相關蛋白而保護心血管系統[17]，說明四逆湯具有多重靶點的作用機制。本研究共發(fā)現四逆湯在防治阿霉素心臟毒性中發(fā)揮作用的有效成分90個、靶點41個，證實了中藥的多成分、多作用靶點機制。

關于四逆湯調控阿霉素心臟毒性的具體機制，研究表明其通過調控Bcl2、caspase3、caspase9、SOD、MAPK相關蛋白而發(fā)揮抑制細胞凋亡、過氧化等機制相關[18-21]。我們研究發(fā)現，四逆湯調控Bcl2、BAX、caspase3、caspase9、SOD、MAPK等蛋白表達，且Capase3、MAPK是關鍵基因，GO富集分析發(fā)現主要生物學過程主要富集與細胞凋亡、對刺激的反應等，與研究報道中的凋亡和過氧化反應一致。阿霉素心臟毒性是一種劑量、時間相關的毒性反應，通過氧化應激、細胞凋亡、鈣功能障礙、拓撲異構酶II 、線粒體功能受損等機制使心肌細胞受損[5,22]。阿霉素通過活化caspase和降解核小體DNA導致了血管內皮細胞和心肌細胞的凋亡[23]， MAPK信號通路是通過氧化應激觸發(fā)細胞凋亡的主要中間體[24]。本研究GO富集顯示四逆湯主要通過凋亡信號通路發(fā)揮保護阿霉素心臟毒性的作用，KEGG富集分析顯示主要涉及的信號通路有caspase和MAPK信號通路，與現有的文獻報道相似。除此之外，排名前10的生物學過程中，與細胞凋亡相關的有7個，我們推測四逆湯在防治阿霉素心臟毒性主要通過調控細胞凋亡通路。

綜上所述, 本文運用網絡藥理學的方法提示四逆湯防治阿霉素心臟毒性涉及多種蛋白功能、多種通路和生物進程，體現四逆湯多成分-多靶點-多途徑緩解阿霉素造成的心臟毒性。但是，四逆湯中20個有效成分未在數據庫中找到對應的靶點，后期我們將結合多個數據庫進一步補充，同時需要實驗進一步驗證。