神經(jīng)復元方對卒中后抑郁大鼠BDNF/TrkB表達及海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響

蔡麗 劉毅 李文濤 陳敏

摘要 目的：研究神經(jīng)復元方對卒中后抑郁（PSD）模型大鼠腦源性生長因子（BDNF）/酪氨酸激酶受體B（TrkB）表達及海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響，探討其改善抑郁癥狀的作用機制。方法：采用經(jīng)典的線栓大腦中動脈加用慢性不可預見溫和應激結(jié)合孤養(yǎng)法，建立PSD大鼠模型，分為假手術組、PSD模型組、氟西汀組、神經(jīng)復元方低、中、高劑量組。造模成功后干預28 d，比較各組大鼠行為學變化，用熒光定量RT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組BDNF/TrkB-mRNA及生長相關蛋白-43（GAP-43）及突觸素I（SYN I）和突觸囊泡素（SYNA）的表達水平，用透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元突觸的超微結(jié)構。結(jié)果：高劑量神經(jīng)復元方干預后的PSD模型大鼠學習記憶功能提升，海馬BDNF和TrkB-mRNA表達比較模型組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），海馬神經(jīng)元突觸相關蛋白SYN I和SYNA的表達水平比較模型組明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。高劑量神經(jīng)復元方組海馬神經(jīng)元突觸密度和突觸后致密物厚度均顯著高于模型組。結(jié)論：神經(jīng)復元方可改善PSD模型大鼠抑郁癥狀，提升大鼠學習記憶能力，其作用機制可能是通過增加海馬BDNF/TrkB的含量，促進海馬突觸素I和SYNA等突觸生長相關蛋白表達，增強PSD模型大鼠海馬神經(jīng)元可塑性而發(fā)揮作用。

關鍵詞 神經(jīng)復元方;卒中后抑郁;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;酪氨酸激酶B;海馬;突觸可塑性;中醫(yī)藥;實驗研究

Effect of Shenjing Fuyuan Decoction on the Expression of BDNF/TrkB and the Synaptic Plasticity of Hippocampal Neurons in PSD Model Rats

CAI Li，LIU Yi，LI Wentao，CHEN Min

（Department of Neurology，Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200071，China）

Abstract Objective：To investigate the effect of Shenjingfuyuan Decoction in regulating BDNF/TrkB signal pathway and the synaptic plasticity of hippocampal neurons in PSD model rats，and to explore its mechanism of improving depression symptoms.Methods：PSD rat model was established by using the classical method of the middle cerebral artery embolism and chronic unforeseeable mild stress combined with solitary nutrition，which were divided into sham-operation group，PSD model group，fluoxetine group，Shenjing Fuyuan Decoction low，middle and high dose group.After 28 days' intervention，the behavioral changes of each group were compared.The expression levels of BDNF/TrkB-mRNA and synapse-related proteins SYN-I，SYNA and GAP-43 were detected by quantitative RT-PCR and immunoblotting.The ultrastructure of hippocampal neuron synapses were observed by transmission electron microscopy.Results：The learning and memory function of PSD model rats was improved after the intervention of high-dose Shenjing Fuyuan Decoction.The expression of BDNF and TrkB gene in hippocampus was significantly higher than that in model group （P<0.01）.The expression of SYN-I and SYNA in hippocampus neurons was significantly higher than that in model group （P<0.01）.The synaptic density and postsynaptic density of hippocampal neurons in the high-dose SD group were significantly higher than those in the model group.Conclusion：Shenjing Fuyuan Decoction can effectively improve the depression of PSD model rats，and improve the learning and memory abilities of rats.Its mechanism may be related to the regulation of BDNF/TrkB signal pathway，promoting the expression of synaptophysin I and SYNA in hippocampus and other synaptic growth-related protein expression，and the enhancement of synaptic plasticity of hippocampal neurons.

Keywords Shenjingfuyuan Decoction; Post-stroke depression; Brain-derived neurotrophic factor; Tyrosine kinase B; Hippocampus; Synaptic plasticity; Traditional Chinese medicine; Experimental study

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.013

卒中后抑郁（Post-stroke Depression，PSD）是卒中后常見并發(fā)癥，嚴重影響患者的神經(jīng)功能康復和生命質(zhì)量，導致腦卒中的復發(fā)率和死亡率明顯增高。據(jù)流行病學數(shù)據(jù)，目前我國PSD發(fā)病率為29%～37.9%[1]。對于PSD的治療近年有很多中藥復方表現(xiàn)出良好治療效果。前期研究證實神經(jīng)復元方對改善PSD患者抑郁癥狀有較好療效[2-3]，但對其作用機制尚無研究。且研究發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）水平與PSD具有相關性。本研究通過建立PSD大鼠模型，予以不同劑量神經(jīng)復元方干預，并設置對照組比較研究，探討神經(jīng)復元方對PSD模型大鼠BDNF/TrkB表達及海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響，進而分析改善PSD患者抑郁癥狀的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

清潔級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，3個月齡，體質(zhì)量（210±30）g，上海實驗動物研究中心提供。所有大鼠分籠喂養(yǎng)于循環(huán)房內(nèi)，溫度（22±2）℃，濕度60%，光/暗周期為12 h/12 h，適應飼養(yǎng)1周，允許動物自由獲取食物和水。所有實驗操作經(jīng)上海市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準并指導進行，盡量減輕動物的痛苦（倫理審批號：2016SHL-KY-20）。

1.1.2 藥物

神經(jīng)復元方，采用單味中藥配方顆粒，由江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供。鹽酸氟西汀膠囊（蘇州禮來制藥有限公司，國藥準字J20170022）。

1.1.3 試劑與儀器 PrimeScriptTM RT reagent Kit（TAKARA公司，日本，貨號：RR037A）、SYBR Premix Ex TaqTM? Ⅱ試劑（TAKARA公司，日本，貨號：RR820A）。兔抗BDNF多克隆抗體（上海威奧生物科技有限公司，貨號：H00000627-D01P）、BDNF免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒（上海威奧生物科技有限公司，貨號：PAB0745）。BCA蛋白濃度測定試劑盒及RIPA裂解液（碧云天生物工程有限公司，貨號：ab174837）。羅氏LC96熒光定量PCR儀（上海土森視覺科技有限公司，型號：Roche LC96）、低溫高速離心機（上海趙迪儀器重點實驗室，型號：TGL20M）、-80 ℃冰箱和4 ℃冰箱（海爾公司，型號：DW-86L828J）、Morris水迷宮（上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XM101）、恒溫浴槽（上海諾頂儀器設備有限公司，型號：HX-101）、Moticam 3000顯微攝影成像系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司，型號：Moticam 3000）、酶標儀（上海土森視覺科技有限公司，型號：BIO-RAD iMark）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將60只健康SD大鼠采用隨機數(shù)字法分為假手術組、模型組、氟西汀組、神經(jīng)復元方高劑量組、神經(jīng)復元方中劑量組、神經(jīng)復元方低劑量組，共6組，每組10只。假手術組每籠飼養(yǎng)5只，共飼養(yǎng)10只，在其他大鼠進行造模的同時，給予相同的MCAO手術流程，但不插入線栓，不進行溫和應激處理和孤養(yǎng)，旨在后續(xù)作為一組排除手術對大鼠抑郁狀態(tài)的影響。模型組和藥物干預組大鼠每籠1只，按以上造模方法進行造模。最后選取8只假手術老鼠為1組，其余5組也各選8只成功造模大鼠。

采用經(jīng)典的線栓法大腦中動脈阻塞手術（MCAO）建立腦缺血模型，加用慢性不可預見溫和應激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)，建立大鼠PSD模型[4-5]。MCAO模型參照改良的Koizumi方法建立[6]。術后24 h按Longa等[7]標準行神經(jīng)功能評分。用蔗糖水消耗試驗評價抑郁模型的可靠程度[8]。

1.2.2 干預方法

中劑量組以臨床常用劑量為標準算出，高劑量組為中劑量組的2倍，低劑量組為中劑量組的1/2倍。假手術組、模型組予以0.9%生理鹽水灌胃，2 mL/d;神經(jīng)復元方高、中、低劑量組按比例予以神經(jīng)復元方?jīng)_劑灌胃，分別按照0.4 g/kg、0.2 g/kg、0.1 g/kg的標準2 mL/d。氟西汀組予以氟西汀灌胃，每日給予5 mg/kg，混懸液2 mL。神經(jīng)復元方的劑量是根據(jù)人日用劑量折算成大鼠日用劑量而成。自第22天起（應激結(jié)束后）連續(xù)干預28 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 糖水消耗與Morris水迷宮測試

糖水消耗測試，實驗開始手術前訓練動物適應含糖飲水，禁水24 h后進行動物糖水消耗試驗[8]。給予每只大鼠定量的1瓶1%蔗糖水，1 h后取走水瓶并稱重（測試前后瓶中蔗糖水消耗）。測試分別安排在手術前、應激第14天、應激第21天和藥物干預第28天進行，記錄大鼠蔗糖水消耗量。

Morris水迷宮測試安排在應激和藥物干預結(jié)束后1星期，采用定位航行實驗測試學習功能，采用空間探索實驗測試記憶功能[4，9]。1）定位航行實驗。通過觀察大鼠從入水到尋找到并爬上平臺所用時間（即逃避潛伏期）來測量其學習記憶能力。前5 d，將大鼠分別從不同的象限放入水中，放入時面向池壁，計算機跟蹤分析大鼠尋找平臺的潛伏期，若120 s內(nèi)仍未找到平臺，則人為引到平臺并停留30 s，此時逃避潛伏期記為120 s。每只動物訓練4次/d，每次訓練之間間隔10 min，連續(xù)訓練5 d。將4次/d的平均逃避潛伏期作為當天大鼠的學習指標。2）空間探索實驗，于5 d訓練結(jié)束后移除平臺，在水池第3象限周邊壁上做黑色三角標記，將大鼠放入任一象限，分析60 s內(nèi)大鼠在平臺所在象限的停留時間（空間探索時間）和跨平臺次數(shù)，作為記憶能力的評價指標。

1.2.3.2 樣本采集方法

待各組大鼠Morris水迷宮測試完成后，分別采集透射電鏡觀察、免疫熒光染色、實時熒光定量PCR（Real-time PCR）所需用腦組織標本和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western-Blotting）所需用海馬組織標本[10]。

1.2.3.3 透射電鏡觀察

采用透射電鏡觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元突觸TEM超微結(jié)構[11]。1）樣品取材：將麻醉大鼠的大腦海馬組織取出，解剖并分離CA3區(qū)，取下組織，組織塊大小約1 mm3。2）固定：將組織塊快速放入2.5%戊二醛、磷酸鹽緩沖液配置的固定液中振蕩固定3 h，然后倒掉固定液，用0.1 mol/L（pH值7.0）磷酸鹽緩沖液漂洗樣品，15 min×3次，再用1%的四氧化鋨在4 ℃磷酸鹽緩沖液中固定2 h，隨后再用0.1 mol/L（pH值7.0）磷酸鹽緩沖液漂洗，15 min×3次。3）乙醇梯度脫水：在4 ℃冰箱內(nèi)，采用50%、70%、90%3種濃度的乙醇溶液對樣品分別脫水15 min，再以90%乙醇與90%丙酮按1∶1配制的溶液脫水15 min，然后90%丙酮脫水15 min。完成后取出，室溫下予以100%丙酮液脫水，15 min×3次。4）包埋劑梯度滲透：室溫下用按照比例2∶1的純丙酮+包埋液處理樣品3～4 h;再用比例1∶2的純丙酮+包埋液處理樣品，過夜;最后在37 ℃用純包埋液處理樣品2～3 h。5）固化：37 ℃烘箱內(nèi)過夜。6）超薄切片機切片，片厚70 nm。7）3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。8）透射電鏡觀察并拍片[12]。

1.2.3.4 實時熒光定量PCR檢測

采用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測BDNF/TrkB mRNA及突觸生長相關蛋白-43（GAP-43）、突觸素I（SYN I）和突觸囊泡素（SYNA）mRNA的表達水平。主要步驟分為Total RNA的提取和鑒定、cDNA合成和定量PCR，最后經(jīng)過上機擴增檢測，利用2-△△Ct法計算各組BDNF、TrKB、GAP-43、SYN I、SYNA的相對表達量[13]。

1.2.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法進行分析，測定PSD大鼠經(jīng)干預后海馬神經(jīng)元突觸相關蛋白SYN I、SYNA和GAP-43的表達水平。主要實驗步驟包括蛋白質(zhì)抽提、蛋白質(zhì)定量、SDS-PAGE電泳、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移及顯像、免疫檢測和化學發(fā)光檢測[13]。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

本實驗PSD大鼠模型成功建立47只，按每組8只分配到假手術組外的其他5組。由于意外等原因，實驗過程中模型組、神經(jīng)復元方低劑量組各死亡1只大鼠。

2.1 各組糖水消耗量比較

手術前，各組糖水消耗差異無統(tǒng)計學意義，應激第14天、第21天，模型組、氟西汀組及高、中低劑量組的糖水消耗量逐步降低，與手術前比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。經(jīng)藥物干預28 d后，氟西汀組、高、中劑量組糖水消耗量較應激第21天時明顯增多，且明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。假手術組糖水消耗量前后無明顯變化。見表1。

2.2 各組大鼠學習與記憶能力受影響情況比較

逃避潛伏期，假手術、氟西汀和高劑量組顯著短于低劑量組和模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;空間探索時間，假手術、氟西汀與高劑量組顯著長于低劑量組和模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。跨平臺次數(shù)，假手術、氟西汀與高劑量組明顯多于中、低劑量組和模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 透射電鏡觀察結(jié)果

與假手術組比較，模型組PSD大鼠的神經(jīng)元突觸體密度（Synapse Density）降低，且突觸后致密物厚度（PSD length）更小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;氟西汀組和高劑量神經(jīng)復元方組神經(jīng)元突觸體密度和突觸后致密物厚度明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1～3。

2.4 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

模型組和低劑量組的BDNF-mRNA表達水平明顯低于其他組，經(jīng)氟西汀和高劑量的神經(jīng)復元方干預后，BDNF的基因表達顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），作為BDNF受體的TrKB的表達也顯著增加。中劑量組的BDNF和TrKB基因表達有所增加，但增加的幅度低于高劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖4～5。

2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法分析結(jié)果

與假手術組比較，PSD模型大鼠中BDNF蛋白及其特異性受體TrKB的蛋白表達顯著受到抑制，但氟西汀和高劑量神經(jīng)復元方可增加PSD模型大鼠BDNF和TrKB蛋白表達水平。PSD模型組SYNA和SYN I的表達比較假手術組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;氟西汀、高劑量神經(jīng)復元方組均可提升SYNA和SYN I的表達，干預后表達水平上升，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組GAP-43的表達水平比較假手術組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但與其他組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖6。

3 討論

慢性溫和不可預見性應激是抑郁癥的一個主要促發(fā)因素，本研究采用經(jīng)典的線栓大腦中動脈加用慢性不可預見溫和應激結(jié)合孤養(yǎng)法建立PSD大鼠模型。建模21 d后，模型組大鼠糖水消耗量和體質(zhì)量明顯減少，在Morris水迷宮中定位航行潛伏期延長，空間搜索時在目標象限的持續(xù)時間及路程縮短、穿越次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學意義，提示建模成功。氟西汀作為一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，具有高度選擇性抑制突觸前膜5-羥色胺再攝取的作用，可增加突觸間隙中5-羥色胺水平，同時還能作用于突觸后膜受體，促進突觸可塑性，起到抗抑郁作用，其療效在臨床實踐和多項研究中已經(jīng)得到充分證實[14-15]。本實驗中，神經(jīng)復元方高劑量與氟西汀一樣，能明顯升高模型大鼠穿越目標象限的次數(shù)，降低在目標象限的潛伏時間，且能增強大鼠食欲，2組糖水消耗量在藥物干預28 d后比較應激21 d時均有所增加。由此證實神經(jīng)復元方在劑量上達到一定程度時可較明顯改善模型大鼠抑郁癥狀，提升大鼠學習記憶功能。

目前，研究者認為抑郁癥發(fā)生是由神經(jīng)可塑性降低引起，且低水平的神經(jīng)可塑性是抑郁癥遺傳傾向性的決定因素[16]。海馬神經(jīng)可塑性主要包括海馬神經(jīng)元的生存、增殖以及突觸形態(tài)的改變，包括神經(jīng)末梢發(fā)芽、生長，形成新的突觸等。神經(jīng)營養(yǎng)因子與神經(jīng)可塑性之間具有緊密的聯(lián)系[17]，BDNF是人體含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子，其主要生理作用是增加突觸可塑性、促進神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)細胞生存，影響神經(jīng)傳導前遞質(zhì)5-羥色胺能（5-HT）和多巴胺能（DA）等的釋放和突觸后遞質(zhì)的傳遞，對各種神經(jīng)元的發(fā)育分化與生長再生起到一定作用，維持神經(jīng)細胞生存。TrkB是BDNF的特異性高親和力受體，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對神經(jīng)元的生存、生長、分化有重要影響[18]。本研究通過實時熒光定量PCR實驗發(fā)現(xiàn)PSD模型大鼠中BDNF及其高親和力受體TrKB mRNA表達顯著受到抑制，而高劑量神經(jīng)復元方和氟西汀一樣可增加PSD模型大鼠BDNF與TrkB mRNA的表達，提示神經(jīng)復元方可能是通過提高海馬組織BDNF和TrkB的表達來發(fā)揮治療PSD的作用。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PSD模型大鼠的突觸密度和突觸后致密物厚度降低，而高劑量神經(jīng)復元方組和氟西汀組，藥物干預后，神經(jīng)元突觸密度和突觸后致密物厚度均明顯增加，提示藥物改善抑郁癥狀可能機制是促進其突觸形成和可塑性改變[19]。

突觸素既是一種突觸囊泡膜的鈣結(jié)合蛋白，其本身的磷酸化亦依賴Ca2+，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、學習記憶及突觸可塑性等作用。SYN I是神經(jīng)元特有的一類與突觸囊泡相連的磷蛋白，在學習記憶及突觸可塑性等生理活動中具有重要作用。SYNA是研究神經(jīng)細胞可塑性的特異性標志物，其表達與神經(jīng)可塑性功能成正比，并參與神經(jīng)元細胞早期非分化突起延伸及其后分化為軸突與樹突的過程。GAP-43是神經(jīng)元特異性磷蛋白，國際上將其作為神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復等神經(jīng)可塑性研究的首選分子探針，是神經(jīng)元軸突再生的分子標志物。本實驗通過Western Bloting分析發(fā)現(xiàn)PSD模型大鼠突觸可塑性相關蛋白SYNA和SYN I的表達以及突觸生長蛋白GAP-43比較假手術對照組明顯降低，提示以上3種蛋白與PSD的發(fā)生有一定關系;同時，發(fā)現(xiàn)經(jīng)高劑量神經(jīng)復元方和氟西汀干預的2組大鼠神經(jīng)元SYNA和SYN I蛋白表達得到提升，與模型組比較差異明顯，GAP-43的表達水平也有所提升但差異不甚明顯。

綜合所述，可見高劑量神經(jīng)復元方在治療PSD模型大鼠時，能顯著提升海馬BDNF及其特異性受體TrKB的mRNA表達，增強PSD模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性。結(jié)果表明，神經(jīng)復元方是一種可有效治療PSD的中藥，其作用機制可能是通過增加海馬BDNF/TrkB的含量，促進海馬SYN I和SYNA等突觸生長相關蛋白表達，增強PSD模型大鼠海馬神經(jīng)元可塑性，從而達到改善抑郁癥狀，提升學習記憶能力的功效。神經(jīng)復元方如何介導BDNF/TrkB信號通路產(chǎn)生作用尚需進一步驗證。

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（2020-03-24收稿 責任編輯：楊覺雄）