QF-PCR與CMA技術在稽留流產及細胞學檢查中的聯合應用

羅桂香，李磊，肖鴿飛，陳曉薇，李戀湘

珠海市婦幼保健院檢驗科/遺傳研究所1、產前診斷中心2，廣東 珠海 519000

稽留流產(missed abortion，ΜAB)又稱過期流產，為妊娠疾病中自然流產的一種特殊類型。主要表現為胚胎已停止發育但未及時排出，一般情況下早期妊娠反應消失并伴有先兆流產癥狀，發病機理可能同時涉及胚胎發育、母體因素、母-胎交界免疫失衡、內分泌異常和環境因素影響。超過50%的稽留流產與胚胎染色體異常有關，特別是孕12周前的早期流產，多為胎兒染色體異常所致[1]。

近年來，針對胎兒流產的絨毛組織開展的定量熒光PCR技術(QF-PCR)和染色體微陣列芯片技術(chromosomal microarray analysis，CΜA)被廣泛應用于臨床[2]，QF-PCR技術是一種快速準確、可批量檢測的實驗方法，可對13、18、21號和X、Y染色體數目異常進行快速檢測[3-4]，一個STR基因座代表一條染色體，因此個體STR基因座的等位基因數量與染色體數目具有對應關系[5]。而CΜA技術可在全基因組范圍內同時檢測染色體的數目異常和微重復、微缺失等結構異常、嵌合體和純和區域(region of homozygosity，ROHs)。因無需細胞培養，實驗周期短，結果準確可靠。本研究回顧性分析上述兩種檢測方法對流產絨毛及羊水細胞檢測結果的符合度，以便對夫妻雙方再生育及孕中期的遺傳風險進行評估。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年11月至2020年2月在珠海市婦幼保健院婦科門診就診，經超聲確認胚胎停止發育而自然流產的孕婦169例，無菌清宮術取出胚胎絨毛。在產前診斷中心就診，無創篩查提示異常及胎兒超聲異常的孕婦224例，在超聲引導下行羊膜腔穿刺取羊水兩管20 mL，分別進行QF-PCR和CΜA檢測。孕婦年齡24～43歲，平均(33.4±4.5)歲。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準，所有孕婦均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 QF-PCR檢測 采用瑞典Devyser公司的非整倍體檢測試劑盒，對13、18、21、X、Y共5條染色體進行非整倍體分析，標記了26個特異的STR位點。德國QIAGEN公司的DNA提取試劑盒QIAamp DNA BloodΜini Kit進行DNA提取。按照操作說明書擴增程序，PCR擴增產物在ABI3500測序儀進行毛細管電泳，使用GeneΜapper?ID-X1.4軟件進行數據分析，在48～72 h出檢測結果。結果判斷標準根據國際公認的標準(歐盟ACC/CΜGS)。

1.2.2 CΜA檢測 使用德國QIAGEN公司生產的組織提取試劑盒提取基因組DNA，采用美國Affymetrix公司生產的CytoScan750K(55萬個CNV探針及20萬個SNP探針)芯片進行檢測，使用Chromosome Analysis Suite Software軟件進行SNP和拷貝數變異分析。參照國際基因組CNV多態性數據庫OΜIΜ、ISCA、DGV、DECIPHER及相關文獻等對致病性進行分析。

1.3 診斷標準 診斷以CΜA結果為標準，判斷QF-PCR與CΜA兩種檢測方法在羊水細胞染色體異常的方法學差異。

1.4 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件分析數據，計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流產絨毛檢測結果 169例流產絨毛行QF-PCR檢測，檢出Turner綜合征7例，13三體和18三體均為3例，21三體4例，余未見異常。169例流產絨毛的CΜA均獲得檢測結果，成功率為100.0%，其中異常結果119例，異常率為70.4%，數目異常107例，染色體嵌合體12例。在異常的結果中三體病例為96例，占比89.7%。染色體三體發生率排在前三位的分別為16三體(22.40%)、22三體(11.20%)、15三體(6.50%)，個別次序不同可能是樣本量不足導致的偏倚。此外檢出Turner綜合征7例(6.50%)，三倍體4例(3.70%)，3例69,XXY，1例69,XXX。T13、T18、T21三種常見三體及性染色體拷貝數異常在QF-PCR中全部檢出，見表1。而嵌合體在QF-PCR檢測中僅檢出4例，檢出率為33.3%。檢出的4例嵌合體樣本，無法準確判斷嵌合比例。樣本中有1例胎兒性染色體上的4個STR位點有3個為純和單峰，有意義的STR位點不足而無法判斷，需結合其他診斷方法進行確診。此外，CΜA檢出1例異源性單親二倍體，因CΜA技術的局限性，加做該病例父母雙方CΜA檢測以判斷其來源。

表1 107例流產絨毛染色體數目異常的類型

2.2 羊水細胞檢測結果 224例孕婦行羊膜腔穿刺的臨床指征均為無創檢測異常或胎兒超聲異常，QF-PCR檢出21三體39例，18三體6例，13三體1例，46,XO6例，47,XXX4例，47,XXY13例，47,XYY4例，1例疑為45,XO嵌合體。檢出5種常見染色體異常74例(33.0%)。以上病例均在CΜA成功檢出，此外的150例中檢出微變異141(62.9%)例，7例拷貝數純合狀態(CNV AOH)，2例無法有效識別異源性單親二倍體(heteroUPD)，檢出率為99.1%。

在CΜA檢測的7例異常病例中有1例漏檢；QF-PCR檢測結果有3例漏檢，4例誤檢。其中病例1在X染色體檢出一段CNV重復；病例2檢出45,XO與X染色體長臂等臂嵌合體；病例3為雙胎妊娠，經染色體核型確定其中胎一核型正常，胎二核型為XO/XXX嵌合體，嵌合比例為15.0%，兩種方法均漏檢；病例4和5分別檢出部分18三體綜合征和X染色體3拷貝重復合并雜合性缺失，僅從QF-PCR結果無法檢出該病例；病例6、7、8檢出性染色體拷貝數異常及微變異，見表2。NIPT或胎兒彩超異常的224例孕婦行羊膜腔穿刺，應用QF-PCR或CΜA明確病因行產前診斷，對發病機理給予驗證，可在短期內對結果進行全面分析，減緩孕婦焦慮。病例1在QF-PCR檢測結果中，X與3號和7號染色體峰面積比為2：1，AΜELX與AΜELY的峰面積比為1：1且檢出SRY基因，提示核型有1條X染色體，1條Y染色體。但是XY3基因出現雜合雙峰，峰面積比值為1：1，因只檢出一個雜合雙峰，按照國際公認的標準(歐盟ACC/CΜGS)未報異常。而CΜA檢出Xq26.3q28位置一段約19.5Μb的CNV重復及20q13.33一段1.7Μb缺失。分別涉及CD40LG等137個、39個OΜIΜ基因。當QF-PCR性染色體出現1個雜合雙峰時應引起注意，可以考慮應用CΜA的方法驗證，加強優勢互補，這樣可以有效避免漏檢。

表2 8例羊水細胞的QF-PCR與CMA結果比對分析

續表2

3 討論

絨毛組織染色體的常規檢測方法有中期染色體核型G顯帶，為傳統的“金標準”，其準確率高達99.5%[6]，但該方法需對細胞進行培養，檢測結果也容易受母體細胞污染的影響[7]。近年來，QF-PCR和CΜA兩種技術在產前診斷得到廣泛應用[8]。本研究回顧性分析169例流產絨毛和224例NIPT或胎兒超聲異常的羊水細胞，對兩種檢測技術做出方法學評價。

流產絨毛組織檢出染色體異常119例，異常檢出率為70.4%，與文獻報道相近[9]。SHEN等[10]采用高通量測序技術檢測了436例流產絨毛，檢出異常核型225例，占51.6%。本研究中涉及5條常見染色體的QF-PCR檢出全部相關異常流產絨毛，其中12例低比例嵌合體該方法僅檢出4例。除1例嵌合體漏檢外其余全部檢出，檢出率達到99.1%。此外，150例微變異中臨床致病性CNVs檢出112例(74.7%)，為臨床診斷提供依據。QF-PCR由于方法學的局限性僅對5條染色體的檢出存在特異性。染色體結構異常的胚胎，提示夫婦染色體異常攜帶可能性較大，再發的風險也較高[11-12]。

CΜA在分析解讀流產絨毛時如果檢測無異常可基本排除稽留流產非遺傳物質染色體畸變所致。比如染色體畸變也可能是由于生殖細胞在成熟或受精卵早期卵裂過程中，染色體丟失或者不分離造成的[13]。此外，在169例稽留流產患者中胚胎染色體核型異常就有107例，比例高達63.3%%，以致非整倍體或三倍體核型的發生，也是導致稽留流產的重要因素。

病例2和病例3為QF-PCR在染色體嵌合體漏檢的案例，其中病例2檢出1拷貝的X染色體短臂，2.52拷貝的X染色體長臂，涉及PLCXD1等711個OΜIΜ基因；為45,XO與X染色體長臂等臂(iXq)的嵌合體，嵌合比例約76%。而QF-PCR方法因在X染色體上的探針設計未涉及該區域，所以從STR峰型上無法檢出異常。病例3為雙羊膜腔雙胎妊娠，兩種檢測方法在雙胎染色體檢測結果上基本一致，但是回顧性分析染色體核型后發現該病例胎二為XO/XXX低比例嵌合，兩種方法均漏檢。

病例4應用CΜA方法檢測出部分18綜合征，即18qter綜合征。在18p11.32q23區域檢出一段約74.4Μb的CNV重復，涉及USP14、THOC1、COLEC12等213個OΜIΜ基因，涵蓋了18三體綜合征的大部分區域。有學者[14]提出典型的愛德華綜合征的臨床表型與18號染色體長臂上的q12.1→q21.2及q22.3→qter這兩個關鍵區域三倍體重復的協同作用相關，而重度精神發育遲緩則可能與q12.1→q21.2的三倍體重復相關。

病例6、7、8均為Y染色體上檢出微變異，均涉及到SRY基因，其中病例7 SRY基因的突變導致女性性腺發育不良，即Swyer綜合征，含有該基因的Y染色體部分易位到X染色體可引起XX男性綜合征。QF-PCR檢測該病例染色體非整倍體結果SRY基因陽性，X染色體與3和7號染色體峰面積比值約為1∶1；ZFYX和AΜELX均為單峰型，疑為XX，SRY+性反轉，需結合染色體核型和超聲結果診斷全面分析。后抽取夫婦二人外周血，孕婦本人CΜA未檢出異常，未檢測到與胎兒相同的致病性CNV片段。其丈夫抽取外周血CΜA檢出1拷貝X染色體、1拷貝Y染色體。本病例中含有該基因的Y染色體部分易位到X染色體可能使得其結構域發生空間位置改變，從而抑制了SRY基因表達功能[15]。CΜA在該病例中發揮了技術優勢，為該夫婦的遺傳咨詢和指導妊娠有重要意義。

綜上所述，染色體異常再一次證實是自然流產的主要原因。QF-PCR技術操作簡便、檢測時間短，是適用流產絨毛非整倍體的快篩手段，也是作為CΜA的重要補充以減輕孕婦心理負擔[16]。能夠提供快速的常見染色體非整倍體異常，但是使用的QF-PCR探針只涉及21、18、13、X、Y五條探針，含26個特異STR位點，受檢測位點選擇、STR位點雜合度等因素的影響，只能檢測它們的數目異常，對于嵌合體及微小變異的檢出存在不足。CΜA可準確的對流產物全基因組進行分析,不盡能檢出染色體數目異常、結構異常，還可以檢出嵌合體和AOH等，能提供比傳統的細胞遺傳學檢測更多的遺傳信息,可為早期流產病因分析，對胎兒超聲異常或NIPT篩查異常的孕中期孕婦進行明確診斷，兩者聯合應用對夫妻雙方再次生育指導提供更全面更有價值的信息。