關于呼和浩特市拇外翻遺傳易感性分析

姜東，樊東升，王繼宏

(內蒙古醫科大學第二附屬醫院手足顯微II科，內蒙古 呼和浩特 010030)

0 引言

拇外翻(hallux valgus，HV)，通常被稱為大腳骨。據流行病學統計拇外翻是足部患病率較高的疾病之一，1950年Hardy和Clapham等學者在拇外翻的隊列研究中發現拇外翻具有遺傳傾向[1]。隨后美國哈佛大學Marian T.Hannan教授也證實，拇外翻具有高度的遺傳性，并強調繼續探究引起拇外翻畸形的遺傳易感性對于拇外翻防治的重要性[2]。近來Yi-Hsiang Hsu等學者用全基因組關聯分析的方法來分析和鑒定拇外翻常見的基因變異位點，研究結果顯示軸抑制蛋白2(Axis Inhibitory protein 2，AXIN2)基因的rs9675316位點變異會增加美國白種男性患拇外翻的風險，脂酶D(Esterase D，ESD)基因的rs7996797位點變異會增加美國白種女性患拇外翻的風險和馬斯GPR家族3(MAS related GPR family member X3，MRGPRX3)基因的rs1563374位點變異會減低美國白種女性患拇外翻的風險，但會增加美國白種男性患拇外翻的風險[3]。

在研究其它一些疾病的遺傳易感性關聯分析后，我們發現在不同地域的人群中，基因的變異位點在疾病發生發展的過程中所起的作用程度不甚相同，甚至作用相反[3]。不同人群中出現的差異多研究證實為單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)。我們的研究在參考國內外類似研究的基礎上，隨機選取一些SNPs在中國呼和浩特市人群中進行相應的實驗論證。建立地區拇外翻SNPs數據庫。為地區性拇外翻畸形提供確切的預防方法及治療手段。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

在2014年10月至2016年12月間從內蒙古醫科大學第二附屬醫院手足顯微外科和內蒙古天瑞體檢中心招募各項客觀條件滿足我們納入標準的拇外翻患者113名及271名健康對照人群。在詳細與研究對象講解我們的實驗目的后，在口頭同意的前提下，抽取每位志愿者5mL外周靜脈血置于紫色美國BD公司的EDTA抗凝管中，冷凍于海爾-80攝氏度冰箱。

1.2 實驗主要試劑及儀器

全血基因組DNA提取試劑盒(西安金磁納米生物技術有限公司)：微磁粒，絲氨酸蛋白酶溶液，紅細胞裂解液，白細胞裂解液，結合液BC，洗脫液ES，清洗液(BW-I，BW-II)。iPLEX? Gold試劑盒(美國Sequenom股份有限公司)：色譜純水，PCR 緩沖液(10×)，氯化鎂(25mM)，Hotstar Taq(5U/ul)，SAP緩 沖 液(10×)，SAP酶(1.7U/ul)，dNTP mix(25mM)，iPLEX 緩 沖 液(10×)，iPLEX酶，Termination mix，SpectroCLEAN樹脂。

1.3 DNA提取

將事先整理好的血液樣本從-80℃冰箱中取出，在常溫下解凍后(若解凍后血液中有凝塊需用漩渦混勻儀震蕩混勻)移入50mL離心管中，遵循西安金磁公司全血DNA純化試劑盒說明書提取全血白細胞DNA。

1.4 引物設計與定制

我們選用Sequenom MassARRY Assay Design 3.0軟件對我們篩選的拇外翻SNPs進行引物及單堿基延伸引物設計。將設計好的延伸和擴增的引物序列送至上海華大基因科技有限公司進行合成。

1.5 PCR反應實驗

將未經任何污染的96孔板按照實際樣本數量編號。為滿足每一個樣本的體積和終密度相同，通過公式Ca×Va=Cb×Vb計算出單個樣本應提取的體積。

將1.8μL進 口 水、0.4μL氯 化 鎂、1μL Primer Mix、0.5μL 10×PCR緩沖液、0.1μL dNTP Mix及0.2μL Hotstar Taq酶混勻，制備成PCR Mix。以 4μLPCR Mix和1μLDNA為一個孔單位，依次加入384孔板，置孔板于PCR儀中。

1.6 SAP純化反應

將1.53μL進 口 水、0.3μL SAP酶、0.17μL SAP緩 沖 液制備成SAP Mix后在漩渦混勻儀上混勻5sec，置離心機5000rpm，10sec，向PCR擴增反應后的孔板每個孔加入2μL。完成上述實驗過程后，置孔板于PCR儀中。

1.7 單堿基引物延伸反應

將0.619μL進 口 水、0.2μL Termination Mix、0.041μL iPLEX酶、0.2μL iPLEX混合液(10)、0.94μL UEP Mix混勻后向孔板中每個孔加入2μL。完成上述實驗過程后，置孔板于PCR儀中。

1.8 樹脂純化、點樣及質譜分析

將384孔板每個空中加入純凈水16μL和樹脂6mg混勻，置入離心機(4000rpm，5min)。此步反應的目的是去除反應體系中的陽性離子。用點樣儀將樹脂純化后的產物(25nl)點到基因芯片上(具體操作遵循操作說明)我們選用Sequenom MassARRAY RS1000 Software[3]，對完成上述操作的基因芯片進行SNP分型。質譜儀我們選用美國Sequenom 公司生產產品。

1.9 統計學分析

我們篩選的SNPs要在健康的對照組中檢測其是否滿足HWE，即PHWE要大于5%。Microsoft Office Excel 2010 Software和SPSS 12.0被用于Chi-square 檢驗和 Fisher精確檢驗[4]。拇外翻的病例組和健康對照組的基因型和等位基因分布差異用Pχ2和PFisher衡量。所有獲得的P值均為雙側，P＜0.05被認為有統計學意義。我們會在顯性模型，隱性模型及加性模型下用比值比(Odds Ratios，OR)和95%可信區間(Confidence Intervals，CI)評估每一個SNP和拇外翻的患病風險。年齡和性別信息被用來進行校正[5]。

2 結果

2.1 樣本的臨床資料

我們共收集的113名拇外翻患者的血樣和271名健康對照人群的血樣。拇外翻組的平均年齡是48.7歲，健康對照組的平均年齡是49.3歲，兩組經過Chi-square檢驗，P值小于0.05，有統計學差異。病例組中有男性13名，女性100名，對照組中有男性98名，女性173名，經過Chi-square 檢驗，P值小于0.05，有統計學差異。詳細信息見表1。

表1 拇外翻病人和對照的基本信息

2.2 Chi-square分析結果

我們共選擇了21個SNP基因分型，其中rs28628238和rs1563374的基因型單一，故這兩個位點的運算結果都沒有意義。位于ESD基因上的rs7996797在等位基因的模型下與我們的對照組存在差異P＜0.05。在等位基因模型下13號染色體上的rs7996797的最小等位基因“G”，OR=1.36，95%CI=1.03-1.94，P=0.04，如表2顯示了我們篩選的21個SNPs基本信息。

表2 候選基因位點的基本信息

2.3 邏輯回歸分型結果

我們所測得數據經邏輯回歸分析，并用性別和年齡校正后發現，在AIC和BIC最小值時，ESD基因rs1923880在隱性模型下能增加拇外翻發病的風險(OR=2.08，95%CI=1.05-4.11，P=0.038)，AXIN2基因rs9915936在隱性模型下能增加拇外翻發病的風險(OR=3.28，95%CI=1.06-10.19，P=0.038)，見表3、4。

表3 1rs1923880位點與拇外翻風險的相關關系

3 討論

AXIN2基因位于17號染色體，根據相關文獻報道該基因能抑制細胞增殖和抑制成骨細胞的分化，進而干擾骨組織的正常代謝。AXIN2基因編碼的主骨架蛋白在Wnt/β-catenin信號通路和TGF-β信號通路參與骨骼的發育[3]，在Wnt信號缺失時，AXIN2會結合GSK-3β和β-連環蛋白，促進在GSK-3β介導下的β-連環蛋白磷酸化，誘導蛋白的泛素化和蛋白酶體的降解[4]。當β-連環蛋白磷酸化時，AXIN2蛋白就會保持穩定。當 Wnt信號存在時，AXIN2會與LRP5/LRP6結合后去磷酸化。包含AXIN2在內形成的蛋白復合物是不穩定的，因此當β-連環蛋白積累到一定數量后被轉移到細胞核內，通過TCF和LEF轉錄因子調節基因的轉錄[3]。Debbie Y.Dao等學者在敲除掉 AXIN2基因的小鼠體內發現，AXIN2基因在小鼠骨骼發育過程中扮演著十分重要的角色[5-8]。美國紐約羅切斯特大學醫學院學者Ying Yan和他的團隊在研究成年鼠的Wnt-β-連環蛋白信號時發現AXIN2在成年小鼠骨骼重建的過程中起著非常關鍵的負調節作用，而且還能通過調節β-連環蛋白-BMP2/4-Osx信號通路參與成骨細胞分化[9]。在2016年美國斯坦福大學的Ransom教授也在研究中發現小鼠骨骼受損后AXIN2-Wnt-β-連環蛋白通路會被激活，參與骨骼的修復與重建[6]。我們實驗結果也證實AXIN2基因的突變會增加拇外翻的患病風險，這與Yi-Hsiang Hsu學者研究的結果一致[3]。rs9915936位于基因的編碼區，該位點的突變影響蛋白質的空間結構，以至于最終影響AXIN2蛋白質的功能，進而使Wnt/β-catenin信號通路發生紊亂，導致骨組織代謝的失調，誘發拇外翻的形成。目前，具體的病理機制和過程還需要我們進一步研究。

表4 rs9915936位點與拇外翻風險的相關關系

ESD基因編碼一種絲氨酸水解酶，參與唾液酸的回收與利用[11]。但增加血清唾液酸水平會引起原發性骨關節炎患者抗氧化水平降低[12]。研究證實拇外翻與ESD基因有關聯，拇外翻的形成與原發性骨關節炎所引起的第一跖趾關節功能異常有關，所以由ESD基因相關的拇外翻形成的機制可能與原發性骨關節炎相似[3]。rs1923880位于ESD基因的內區，該位點的A到G的變異增加了拇外翻的發病風險，其原因可能是在遺傳信息轉錄后在剪切的過程受到影響，進而使ESD基因表達異常。我們的實驗結果和美國的Josephine Hoh教授的GWAS結果相同，進一步證明rs1923880位點的變異與拇外翻風險的相關性[13,14]。

雖然我們在MRGPRX3基因、AXIN1基因和BBS9基因所篩選的SNPs沒有顯示出與拇外翻的關聯性，但是由于我們的實驗樣本的限制，并不能證明它們之間就沒有相關性。

MRGPRX3蛋白是MAS相關/ G蛋白偶聯受體的感覺神經元特異性亞家族，當前人們對MRGPRX3基因研究甚少，在2005年該基因被日本Kaisho教授首次報道，證明該基因的過表達將導致轉基因小鼠發生白內障和皮膚病[15]。最新的研究表明該基因編碼的蛋白可能參與了感覺神經元的調節和痛覺和/或瘙癢的調節[3]，以及該基因某個位點的變異將會導致拇外翻的發生[16]。目前該基因的功能上不完全清楚，僅僅根據Yi-Hsiang Hsu學者的研究，猜測該基因可能與骨骼代謝有關。

AXIN1蛋白也叫膜聯蛋白I，屬于Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，是合成有效的炎性介質、前列腺素及白三烯所必須的蛋白之一，AXIN1蛋白可能有潛在的抗炎活性。炎癥眾所周知的與原發性骨關節炎相關[17]。Yi-Hsiang Hsu學者也證實AXIN1基因的中的SNPs會增加女性患拇外翻的風險[3]。其與AXIN2基因共同參與Wnt/β-catenin信號通路和TGF-β信號通路，影響拇外翻發生和發展的過程相類似。

BBS9基因位于7號基因編碼鏈上長度約為476.82kb，從33168857到33645680，根據目前Pubmed所有關于BBS6基因研究成果顯示，成骨細胞中的甲狀旁腺激素會下調該基因的表達，因此被認為其參與甲狀旁腺激素在骨骼中的代謝，但目前該基因功能尚未確定(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research)。根據美國國家人類基因研究所的GWAS研究顯示，BBS9基因的易感位點和新生兒的顱骨矢狀縫閉合時間具有密切的相關性，這表明BBS9基因可能在骨骼發育中發揮重要的作用[18]。另外BBS9基因對于拇外翻的影響可能與足部骨骼和周圍的軟組織受到的長期復雜的過程有關[3]。

我們的實驗采用的候選基因的策略，共篩選了21個SNPs在中國呼和浩特漢族人群中進行驗證，探究了不同人群相關SNPs與拇外翻易感人群上的差異。通過我們的實驗研究，可以得到以下結論：

(1)ESD基因和AXIN2基因可能與呼和浩特人群拇外翻的發病風險有關。

(2)ESD基因中的單體型“G”比野生單體型增加拇外翻的風險。