液態奶中硫氰酸鈉殘留的2種快速檢測方法優化研究

姚明奇，斯琴朝克圖，吳菘建，戴余軍，姜益泉，張楊，章愛群,3

（1.湖北工程學院生命科學技術學院，湖北孝感 432000；2.湖北省植物功能成分利用工程技術研究中心，湖北孝感 432000；3.生態毒理與食品安全研究中心，湖北孝感 432000）

0 引 言

硫氰酸鈉（Sodium Thiocyanate，STC）是一種具有殺菌作用的添加劑[1-4]，進入人體后釋放氰根離子，使組織出現氧利用功能性障礙[5]，超量STC還會阻礙人體對碘的吸收[6-7]。因此，世界各國嚴禁在牛奶中添加或限量添加STC[8-9]。我國“2015年食品安全抽檢監測項目參考值”中規定，液體乳中SCN含量的參考值為10 mg/kg[10-12]。STC的常用檢測方法，如高效液相色譜法[13]、氣相色譜-質譜法[14]、離子色譜法[15]、表面增強拉曼光譜[16,-17]、離子色譜或離子色譜-質譜聯用儀[18-21]等，具有前處理方法復雜、儀器設備昂貴，不適合現場操作的缺點。本文選擇紫外-可見分光光度法和目視法兩種快速檢測方法，通過單因素篩選、正交設計等方法改進和優化，旨在為中小企業和監管部門提供檢測靈敏度高、結果穩定、操作簡便快速、價格便宜的檢測方法，提高檢測效率，減少商家損失。

1 實 驗

1.1 儀器與設備

T 9CS型紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋，上海科恒實業發展有限公司；TG16G型低速臺式離心機，上海趙迪生物科技有限公司；FA1004N型電子天平，上海菁華科技儀器有限公司；XMTD-8222型電熱鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；Direct-Q 3超純水系統，美國密理博（Millipore）公司；JOYN-30AL型智能超聲波清洗機，上海喬躍電子有限公司；常用玻璃儀器，在使用以前均于鹽酸與硝酸混合液中浸泡過夜，在超聲波清洗器中洗凈，用去離子水沖洗3次備用。

1.2 藥品與試劑

牛奶，市售。

STC（分析純），上海山浦化工有限公司；十二水合硫酸鐵（Ⅲ）銨（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；三氯化鐵（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；硫酸鐵（分析純），天津博迪化工股份有限公司；硝酸鐵（分析純），山東西亞化學股份有限公司；水合高氯酸鐵（分析純），源葉生物有限公司；硝酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；硫酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；高氯酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；結晶紫（分析純），中國遠航化工廠；三氯乙酸（分析純），上海麥克林化學試劑有限公司；過氧化氫（質量分數為30%，分析純），天津市天力化學試劑有限公司；乙醇（體積分數為95%，分析純），國藥集團化學試劑有限公司。

STC標準溶液（0.1 g/L）：精密稱取STC 10.00 g，將其放于電熱鼓風干燥箱內105℃烘干至恒重，取出密封保存。精密稱取恒重后的STC 1 000 g，用少量超純水溶解并轉移至1 000 mL容量瓶中，用超純水定容至1 000 mL，搖勻，得STC母液（1 g/L）。再精密量取STC母液10 mL，轉移至100 mL容量瓶中并用超純水定容至100 mL，搖勻，得STC標準溶液（0.1 g/L），于4℃冰箱保存。

硝酸（1∶6）：量取1體積的濃硝酸（體積分數為65%～68%）與6體積的超純水水加入500 mL容量瓶中，搖勻。

鐵鹽溶液（質量濃度160 g/L）：分別精密稱取硫酸鐵銨，三氯化鐵，硫酸鐵，硝酸鐵，高氯酸鐵16.00 g，加入少量水溶解，再滴加1 mL各鐵鹽酸根相對應的酸。轉移至100 mL容量瓶中并用超純水定容至100 mL，搖勻。

三氯乙酸溶液（質量濃度100 g/L）：精密稱取三氯乙酸100.00 g，加入適量超純水溶解，再將溶液轉移至1 000 mL容量瓶中，用超純水定容至1 000 mL，搖勻。

過氧化氫溶液（質量分數1%）：用移液管量取過氧化氫溶液（質量分數30%）3.33 mL于100 mL容量瓶中，用超純水定容至100 mL，搖勻，于4℃冰箱保存。

結晶紫指示劑（質量濃度1 g/L）：精密稱取結晶紫0.100 g，用少量體積分數95%乙醇溶解并轉移至100 mL容量瓶中，用超純水定容至100 mL，搖勻。

1.3 紫外-可見分光光度法

本方法是在公開發表的相關文獻[15-24]基礎上，選擇文獻方法中重復率較高，具有一定代表性的不同因素、不同水平和操作步驟作為模板，通過單因素篩選和正交實驗優化確定最優條件。

檢測波長的確定：取STC標準液10 mL加入硝酸1 mL酸化，加入顯色劑硫酸鐵銨溶液1 mL，反應5 min，定容至25 mL。用紫外-可見分光光度計在400 nm～900 nm波長范圍內掃描，確定STC的最大的吸收波長為451 nm。

操作步驟模板：精密量取牛奶10.0 mL置于50 mL離心管中，再精密量取超純水10.0 mL置于另一只同規格的離心管中。每管中分別加入三氯乙酸溶液30 mL和過氧化氫溶液0.5 mL。用電熱恒溫水浴鍋于60℃水浴加熱5 min。待溶液冷卻后，3 500 r/min轉速離心5 min，取上清液于4℃冰箱分別保存。超純水（空白）和樣品上清液各取10 mL置于25 mL容量瓶中，加入硝酸1 mL酸化，用鐵鹽溶液1 mL顯色后，反應5 min，用超純水定容。以空白液調零，用紫外-可見分光光度計于451 nm處測量吸光度。

標準曲線的繪制：準確量取STC標準溶液（質量濃度0.1 g/L），用超純水配制成質量濃度梯度分別為0，0.5，1，2，4，8，16μg/mL的STC系列標準溶液。分別從上述7個STC系列標準溶液中取10 mL，置于7只25 mL容量瓶中，編號1～7，每瓶加入硝酸1 mL酸化，再分別加入顯色劑鐵鹽溶液1 mL，反應5 min，用超純水定容。1號管作為空白對照，用紫外-可見分光光度計于451 nm處平行測定3次。以STC質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度（Abs）為縱坐標，繪制標準曲線。

檢出限：取上述操作步驟模板中的空白溶液10 mL，置于25 mL容量瓶中，加入硝酸1 mL酸化，然后加入顯色劑硫酸鐵銨溶液1 mL，反應5 min，用超純水定容至25 mL。用紫外-可見分光光度計于451 nm處測定吸光度，共測定20次。依據公式LOD=+K×SD（x—平均數；SD—標準偏差；K—常數，取3）計算儀器檢出限LOD，此公式適用于各種光學分析方法。

準確度與精密度：向牛奶樣中加入適量STC標準溶液，使其質量濃度分別為高質量濃度組0.05，0.10，0.15 g/L和低質量濃度組0.005，0.010，0.015 g/L。采用上述操作步驟模板制備樣品，用紫外-可見分光光度計檢測，回收率采用單點校正法計算。同一天內每個質量濃度5個平行，計算日內相對標準偏差，每種樣品重復5 d，計算日間相對偏差。檢測時未加標樣品作為空白對照，減除背景值，計算其回收率。計算公式：回收率/%=（加標液質量濃度-空白樣品質量濃度）/加標液質量濃度×100%。

單因素實驗：本文對液態中STC殘留UV-VIS快速檢測方法的不同操作條件進行了單因素實驗設計篩選。按照上述操作步驟模板作為基礎，對三氯乙酸質量濃度、離心機轉速、硝酸的用量、顯色劑種類和用量、顯色時間等條件，每次只改變相應單因素變量，其它條件不變時，測定吸光度確定最合理的水平，3次平行測定。各單因素變量設計如表1所示。

表1 牛奶中STC殘留的UV-VIS快速檢測方法單因素變量設計

正交實驗：為了進一步優化實驗條件，在單因素實驗結果基礎上，針對液態奶中STC殘留UV-VIS快速檢測方法進行4因素4水平（L16(44)）正交實驗，結果如表2所示。以標準步驟模板為基礎，按照正交實驗表每個實驗序號相應的三氯乙酸質量濃度、離心機轉速、顯色劑用量和硝酸用量進行優化，平行操作3次。

表2 牛奶中STC殘留UV-VIS快速檢測方法的L16(44)正交實驗設計

1.4 目視比色法

標準比色卡的制作：準確量取STC標準溶液（質量濃度0.1 g/L），用超純水配制成質量濃度梯度分別為0，2，5，10，20，50，100μg/mL的STC系列標準溶液。分別從上述7個STC系列標準溶液中取10 mL，置于7只25 mL容量瓶中，編號1～7，分別加入硝酸1 mL酸化，再分別加入顯色劑三氯化鐵溶液1 mL，反應5 min，用超純水定容，三組平行操作。選顏色區別最為明顯的一組溶液作目視比色法的標準比色卡。

目視比色牛奶樣品制備：精密量取牛奶10.0 mL置于50 mL離心管中，加入三氯乙酸溶液30 mL和過氧化氫溶液0.5 mL。用電熱恒溫水浴鍋60℃水浴加熱5 min。待溶液冷卻后，3 500 r/min轉速離心5 min。取上清液于4℃冰箱保存。取上清液10 mL，加入硝酸1 mL酸化，加入顯色劑硫酸鐵銨溶液1 mL，反應5 min。與標準比色卡對比，獲得牛奶中所含STC含量區間。

顯色劑的選擇：準備牛奶樣品6份，分別命名為A1，A2，B1，B2，C1，C2；其中顯色劑A為三氯化鐵作為顯色劑，B為硝酸鐵作為顯色劑，C為硫酸鐵銨作為顯色劑，1為空白，2為加標STC至質量濃度為10μg/mL，目視對比顯色劑的顯色優劣。

指示劑的選擇：按目視比色法標準步驟準備比色卡，再準備牛奶樣品兩份，其中一份不加標，一份加標STC至質量濃度為10μg/mL。依照上述標準操作步驟操作時，在滴加顯色劑之前分別加入所選兩種指示劑羅丹明B和結晶紫幾滴，目視對比兩種指示劑顯色優劣。

STC含量計算公式為

STC質量濃度=(CV2V4)/(V1V3)，

式中：C為待測液中STC的質量濃度（μg/mL）；V1為量取樣品的體積（mL）；V2為上清液的總體積（mL）；V3為添加的上清液體積（mL）；V4為待測液總體積（mL）。

2 結果與分析

2.1 紫外-可見分光光度法的優化

標準曲線與線性關系：在不同顯示劑條件下每個試樣平行操作3次，取其平均值，并繪制標準曲線，其標準曲線回歸方程與相關系數結果如表3所示。結果表明，在設定質量濃度范圍之內有著良好的線性關系和相關性，滿足本文定量分析要求。

表3 不同顯示劑條件下的STC標準曲線回歸方程與相關系數

儀器檢出限：采用UV-VIS方法于451 nm處測定空白樣品20次，其數據如表4所示。根據本文1.3所示檢出限計算公式可確定本方法檢出限（LOD）為2.699 g/mL。

表4 UV-VIS方法在451 nm波長處測定空白牛奶中STC殘留質量濃度

回收率與精密度兩組牛奶中6個質量濃度STC添加回收率如表5所示。結果表明，高質量濃度范圍內回收率在92.64%～98.88%之間，RSD為0.4447%～2.452%；低質量濃度范圍內回收率在93.63%～95.47%之間，RSD為3.763%～6.797%。均可滿足定量分析方法需要。

表5 STC在牛奶中的添加回收率（n=3）

單因素篩選：首先通過不同單因素變量對STC在牛奶中的回收率或吸光度，比較單一因素變化時其含量檢測的影響。實驗結果表明，添加不同顯色劑時，硫酸鐵與牛奶上清液形成很深的底色，嚴重干擾檢測結果，故排除硫酸鐵作為顯色劑的可能。添加其它顯色劑時STC在牛奶中的回收率順序為高氯酸鐵（99.19%）＞硫酸鐵銨（98.83%）＞硝酸鐵（98.11%）＞三氯化鐵（97.52%）。高氯酸鐵的市場價格遠高于硫酸鐵銨，且高氯酸鐵與硫酸鐵銨的回收率差異較小，故本實驗選擇硫酸鐵銨作為優選顯色劑。

三氯乙酸質量濃度、離心轉速、硝酸的用量、顯色劑的用量、反應時間等變量對吸光度的影響如圖1所示。因牛奶中的蛋白質影響吸光度的測定，故本方法采用三氯乙酸去除牛奶中蛋白質。在其它處理條件相同時，僅改變三氯乙酸的質量濃度，樣品溶液的吸光度在三氯乙酸質量濃度為100 g/L時達到頂峰，并隨著三氯乙酸質量濃度的上升而逐漸下降。沉淀牛奶中的蛋白質時如果采用過濾方法，則造成大量溶液損失，故本方法采用離心法。實驗結果表明，溶液的吸光度隨著離心轉速的增大而增大，在離心轉速達到4500 r/min時達到了頂峰，之后又開始下降。硫氰酸根在酸性的條件下與鐵離子絡合形成血紅色的硫氰酸鐵，需添加硝酸提供氫離子進行酸化。實驗結果顯示，當硝酸用量達到1 mL時，吸光度最高。隨著硝酸用量的增加而吸光度逐漸降低。需要說明的是，配備顯色劑時滴加的鐵鹽導致未加硝酸的溶液依然在451 nm處有一定的吸光度。關于顯色劑的用量，當顯色劑滴加到1 mL時，樣品吸光度達到最高點。之后隨著顯色劑用量的增加而吸光度不斷降低。同時，空白對照試劑的顏色隨著顯色劑用量的增加而加深。因為，鐵鹽溶液本身有顏色，會隨著顯色劑的增加底色不斷加深。樣品中各種化合物添加后，反應時間的優化是從2 min開始逐漸增加到30 min。實驗結果表明，反應時間2 min時吸光度最高，5 min之后下降較為明顯。操作過程中發現2 min的反應時間過短，不易操作。因此，5 min作為反應時間較為合適。

圖1 不同實驗條件對UV-VIS吸光度（Abs）的影響

正交實驗：通過單因素篩選實驗，確定硫酸鐵銨作為優選顯色劑，顯色時間為5 min。因此，本文主要針對三氯乙酸質量濃度、離心機轉速、顯色劑用量和硝酸用量進行正交實驗優化。正交實驗條件、因素、水平及相應序號見表6，正交實驗直觀分析結果如表7所示。結果表明，各水平平均數的差值R的絕對值從大到小依次為RC＞RB＞RD＞RA。即，對實驗影響最大的是顯色劑的用量，其次是離心轉速，而硝酸用量和三氯乙酸的質量濃度影響較小。

表6 正交實驗條件的因素和水平相應序號

表7 牛奶中STC殘留UV-VIS檢測方法的正交實驗結果

對正交實驗表6進行方差分析（如表8所示）后的結果表明，三氯乙酸質量濃度，離心轉速，顯色劑的用量，硝酸用量等4種變量的F值均大于F0.05，處理間的差異達到了顯著水平。三氯乙酸質量濃度和硝酸用量的F值大于F0.01，處理間的差異達到了極顯著水平。通過正交實驗結果獲得A1B2C2D2組合實驗結果最佳。但單因素實驗結果顯示，最佳對應條件分別 為A2、B3、C2和D3。因此，通過進一步增加了A2B3C2D3組合和A1B2C2D2組合對比實驗。結果表明，A2B3C2D3組合實驗結果更優，且更加穩定可靠。即樣品前處理時用100 g/L的三氯乙酸沉淀蛋白質，4 500 r/min的轉速離心，取上清液滴加硝酸1 mL酸化，再滴加顯色劑硫酸鐵銨1 mL，顯色反應5 min，檢測波長為451 nm。

表8 正交實驗結果的方差分析

2.2 目視比色法的優化

目視比色法的標準比色卡如圖2所示。圖中標號1～7比色管中STC質量濃度分別為0，2，5，10，20，50，100μg/mL。結果表明，比色卡的顏色從1～7逐漸加深，最終變成橙紅色。因此，經過處理后的牛奶樣品，以其顏色深淺判斷牛奶中STC質量濃度是否超標。未處理的牛奶中也有一定量的氰酸鈉存在，但牛奶行業普遍規定牛奶中STC的質量濃度不得超過10μg/mL，既樣品顏色深于圖4中4號管的顏色時可判斷為實樣中的STC的質量濃度超過規定限量。

圖2 目視比色法標準比色卡

在顯色劑優化實驗中，本文選用三氯化鐵、硝酸鐵、硫酸鐵銨作為考察顯色劑，對比3種顯色劑的顏色顯示對比度。結果表明，硝酸鐵作為顯色劑時顏色對比度更明顯，易于目視法判斷STC在牛奶中的質量濃度是否超過規定限量10μg/mL（如圖3所示）。

圖3 牛奶中STC目視法檢測的不同顯色劑的選擇

不同指示劑的對比實驗結果表明，當比色卡和牛奶試樣中均不加指示劑時如圖4（a），試樣中STC質量濃度在10μg/mL左右或不超過超過20μg/mL情況下顏色對比度可用目視法判斷。當以結晶紫作為指示劑時如圖4（b），牛奶樣品溶液的不同質量濃度顏色差異顯示更加明顯，低于STC質量濃度100μg/mL時均能判斷大致質量濃度區間。

圖4 牛奶試樣中不滴加指示劑（a）和滴加結晶紫指示劑（b）后的對比

3 討 論

此前，UV-VIS方法檢測不同介質中STC殘留研究顯示，大部分都利用硫氰酸根（SCN-）在酸性條件下和Fe3+絡合生成血紅色絡合物硫氰酸鐵[10,22-27]。報道中操作步驟各有特點，所選用試劑各異，檢測波長也不同。2009年，水明等[23]用三氯乙酸沉淀蛋白質，超聲提取后用中速濾紙過濾得上清液，向上清液中加入三氯化鐵顯色劑，于457 nm波長處測定STC的含量。此后伍金娥等[24]和付冬梅等[25]也進行了三氯化鐵顯色劑的比色實驗，檢測波長為455 nm。2010年，李衛群等[26]對方法進行了優化，在樣品中加入三氯乙酸溶液和雙氧水，將溶液置于60℃水浴進行蛋白質沉淀后，離心分離蛋白質，取濾液加入硝酸酸化，與硫酸鐵銨顯色反應，在465nm處測定吸光度計算STC含量。2012年，陳慧珠等[27]選用了另一種方法進行測定，即將牛乳樣品處理過后，在50℃中性磷酸鹽緩沖液的條件下，硫氰酸根會與氯胺T（Chloramine T）反應生成氯化氰，再和異煙酸反應生成戊烯二醛，最后與吡唑啉酮縮合生成藍色染料，在638 nm測定吸光度。2019年，Silva Júnior等[28]用微泵多換向流系統成功地應用于硫氰酸根的測定，并鑒別吸煙者與非吸煙者唾液樣本進行鑒別分析，檢測波長為480 nm。STC含量檢測中離子色譜方法是一種監督檢查使用的常用方法。雖然，其結果可靠、穩定性好，但檢測周期長、前處理復雜、費用較高。如，中華人民共和國農業行業標準，生乳中硫氰酸根的測定離子色譜法[29]及葉巧燕等[21]建立的離子色譜方法檢測生乳中硫氰酸根的方法的前處理方法均需要過濾、反向凈化小柱凈化等復雜且耗費較大的步驟。

本文在上述文獻基礎上進行比較和謹慎對比，并通過對不同添加方式、試劑種類和用量等條件進行單因素篩選、正交設計等方法改進和優化，最終確定了鮮牛奶中STC殘留UV-VIS檢測方法。本方法的前處理用100 g/L的三氯乙酸沉淀蛋白質，4 500 r/min的轉速離心，取上清液滴加硝酸1 mL酸化，再滴加顯色劑硫酸鐵銨1 mL，顯色反應5 min，用分光光度計于451 nm處測定吸光度。該檢測方法檢出限為2.699μg/mL，精密度RSD（%）值為2.212，加標回收率在93.63%～95.47%之間。結果表明，該方法對鮮牛奶中STC殘留的檢測效果良好，結果穩定可靠，且每次實驗所需時間均在10 min左右，檢測成本低廉。適用于各中小企業對自家生產的牛奶進行自我檢測，也適用于監管部門對市售牛奶進行快速檢測。

通過對目視比色法的不同顯色劑、不同指示劑和其它試劑的用法和用量進行對比后最終確定了下述操作步驟：分別準確量取STC標準溶液（質量濃度0.1 g/L）用超純水配制成質量濃度梯度分別為0，2，5，10，20，50，100μg/mL的STC系列標準溶液。分別從上述7個STC系列標準溶液中取10 mL，置于7只25 mL容量瓶中，編號1～7，分別加入硝酸1 mL酸化，加入數滴結晶紫指示劑，再分別加入顯色劑三氯化鐵溶液1 mL，反應5 min，用超純水定容，三組平行操作。選顏色區別最為明顯的一組溶液作目視比色法的標準比色卡。然后再取空白牛奶樣品和實樣牛奶樣品以上述方法操作后與標準比色卡對比顏色，確定樣品中STC質量濃度區間。此方法操作簡單、試劑易得、檢測速度快，同樣適用于各中小企業對自家生產的牛奶進行自我檢測，也適用于監管部門對市售牛奶進行快速檢測。