基于肝素-丙二醇酯的新型磁共振對比劑用于小鼠腫瘤成像

鄭欽允，聶 蕾，侯若瑩，唐文英，張?bào)w江

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院影像科 貴州省醫(yī)學(xué)影像中心，貴州 遵義 563003)

腫瘤MR增強(qiáng)成像一直是臨床關(guān)注重點(diǎn)[1]，其強(qiáng)化特點(diǎn)有助于鑒別不同類型腫瘤，并判斷其良惡性[2-3]。目前臨床常用MR對比劑主要為小分子釓(Gd3+)對比劑，如釓噴酸葡胺(DTPA-Gd)、釓特酸葡甲胺(DOTA-Gd)等，存在靶向性較差、組織對比度欠佳和成像窗口時(shí)間較短等缺陷[4-6]，欲達(dá)到理想成像效果，需要采用較高注射劑量和流率，易致Gd3+滯留，增加毒副作用如腎源性系統(tǒng)性纖維化和腦內(nèi)Gd3+沉積等風(fēng)險(xiǎn)[7-9]。因此，研發(fā)組織對比度更高、靶向性更強(qiáng)、成像窗口時(shí)間更長且毒性較低的新型MR對比劑已經(jīng)成為當(dāng)前國內(nèi)外MR腫瘤成像的重要研究方向之一[10-11]。本研究觀察基于肝素-丙二醇酯的新型MR對比劑Gd-PPF-SS-CA用于小鼠皮下瘤成像的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 4T1細(xì)胞取自小鼠乳腺癌細(xì)胞系(購自上海生命科學(xué)研究院)，經(jīng)兩次傳代后用于建立腫瘤模型。20只8～10周健康雌性BALB/c小鼠(購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，體質(zhì)量(20±2)g。將4T1細(xì)胞接種于10只小鼠背部皮下，接種細(xì)胞量為7×105個(gè)，待1周后腫瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí)用于在體MR成像。Gd-PPF-SS-CA(Gd3+濃度為6.48 g/L)由四川大學(xué)生物材料學(xué)院合成，以PPF為載體，通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合反應(yīng)引入一個(gè)酶敏感的短肽(GFLG)于其內(nèi)，再通過點(diǎn)擊反應(yīng)將DOTA-Gd和還原敏感的二硫鍵分別連接于載體材料的側(cè)鏈而最終制得。DTPA-Gd購自瑞禧生物公司。本研究獲得四川大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 體外測定弛豫率 將Gd-PPF-SS-CA和DTPA-Gd配成不同Gd3+濃度(0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35，0.40 mmol/L)制劑。以GE 3.0T Architect MR掃描儀對其行常規(guī)自旋回波(spin echo, SE)序列T1W掃描，參數(shù)： TE 8.7 ms，TR 20、30、50、70、90、125、150、175、200、300、400、500、700、850 和1 000 ms，F(xiàn)OV 200 mm×200 mm，層厚2.0 mm，矩陣256×256。在后處理工作站對圖像進(jìn)行圈值，獲得相應(yīng)1/T1值，根據(jù)1/T1與Gd3+濃度之間的線性關(guān)系斜率得出兩種MR對比劑的縱向弛豫率(r1)值。

1.3 在體MR檢查 將10只荷瘤雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組5只，分別以Gd-PPF-SS-CA和DTPA-Gd為對比劑，以配備小鼠線圈的臨床GE 3.0T Architect MR儀行平掃及增強(qiáng)MR掃描。先使用異氟烷氣體麻醉小鼠，對腫瘤部位采集平掃SE-T1WI，TR 400 ms，TE 14 ms，F(xiàn)OV 60 mm×60 mm，體素0.2 mm×0.2 mm×1.5 mm，層數(shù)12，層間距1.2 mm，獲得注射前信號強(qiáng)度(signal intensity, SI)。之后按照0.08 mmol Gd/kg體質(zhì)量經(jīng)尾靜脈注射對比劑，并分別于注射完后10 min、0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h及8.0 h采集圖像及相對器官SI，與注射前比較獲得注射前后信號變化值(SI%)。

1.4 Gd-PPF-SS-CA在體急性毒性作用 將10只健康小鼠隨機(jī)分為Gd-PPF-SS-CA組與生理鹽水組各5只，分別靜脈注射0.08 mmol Gd/kg體質(zhì)量或同等量生理鹽水。24 h后解剖動(dòng)物，取出心、肝、脾、肺、腎等主要臟器用于病理組織分析，觀察Gd-PPF-SS-CA在體急性毒性作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。采用方差分析和t檢驗(yàn)比較各組間體外弛豫率磁共振SI和體內(nèi)腫瘤部位強(qiáng)化程度差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外弛豫率 Gd-PPF-SS-CA的SI%高于DTPA-Gd(248% vs 132%，F(xiàn)=9.87，P<0.05)，r1分別為12.87 L/(mmol·s)和3.51 L/(mmol·s)，前者為后者的3.67倍，見圖1。

圖1 體外縱向弛豫率比較 A.T1WI； B.r1

2.2 在體腫瘤部位成像 實(shí)驗(yàn)組注射對比劑后腫瘤部位SI逐漸增加，注射后10 min～2 h內(nèi)持續(xù)增強(qiáng)，2 h時(shí)達(dá)強(qiáng)化峰值(圖2)，隨后強(qiáng)化程度下降，8 h仍可見強(qiáng)化；對照組腫瘤有效成像窗口時(shí)間僅0.5 h(圖2)。實(shí)驗(yàn)組最大增強(qiáng)幅度為128.43%，高于對照組的48.20%(t=0.0015，P<0.05，圖3)。

圖2 2組腫瘤T1WI比較

圖3 2組腫瘤部位SI%(*：P<0.05)

2.3 Gd-PPF-SS-CA在體急性毒性作用 靜脈注射0.08 mmol Gd/kg體質(zhì)量及同等量生理鹽水后24 h內(nèi)小鼠均未表現(xiàn)出明顯急性毒副作用(如出血、運(yùn)動(dòng)共濟(jì)失調(diào)、死亡等)。處死、解剖后觀察，Gd-PPF-SS-CA組與生理鹽水組均未見明顯組織損傷和組織病理學(xué)異常如炎癥、壞死、萎縮及組織變形等。見圖4。

圖4 組織病理學(xué)觀察Gd-PPF-SS-CA在體急性毒性 A.注射生理鹽水(HE，×10)； B.注射生理鹽水(HE，×20)； C.注射Gd-PPF-SS-CA(HE，×10)； D.注射Gd-PPF-SS-CA(HE，×20)

3 討論

本研究以聚肝素-丙二醇酯(poly-heparin propanediol ester, PPF)大分子為載體，通過化學(xué)鍵將小分子Gd3+螯合物與其連接，并在主鏈結(jié)構(gòu)中引入二硫鍵，使其可被谷胱甘肽降解，以實(shí)現(xiàn)在腫瘤高靶向、高對比和長時(shí)間成像的同時(shí)迅速釋放小分子Gd3+螯合物，從而顯著降低直至避免Gd3+滯留所帶來的潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)，提高其安全性。

3.1 體外弛豫率分析 弛豫率決定著MR對比劑的增強(qiáng)效果。高弛豫率MR對比劑應(yīng)具有能與大量水分子配位結(jié)合的順磁性物質(zhì)、較短的水相抵抗時(shí)間和相對慢的旋轉(zhuǎn)速率，故既往研究[12]多從上述方面入手，以提高對比劑的弛豫率。聚合物對比劑的弛豫率與分子量、分子大小及其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[13]。本研究重點(diǎn)加大Gd-PPF-SS-CA的分子量，增加其分子徑線，有利于降低其分子旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)、提高旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間，進(jìn)而提升材料中Gd3+與水分子的交換時(shí)間和速率，最終使Gd-PPF-SS-CA縱向弛豫率(r1)大幅增加。

3.2 體內(nèi)腫瘤成像 量化分析實(shí)驗(yàn)組與對照組腫瘤MRI，發(fā)現(xiàn)Gd-PPF-SS-CA對腫瘤MRI信號的最高增幅達(dá)128.43%，約為相同條件下DTPA-Gd(48.20%)的2.66倍。分析原因，Gd-PPF-SS-CA體外弛豫效能遠(yuǎn)高于DTPA-Gd，其分子量更大，能更有效地通過高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect)而高度聚集于腫瘤組織，增強(qiáng)效果更為顯著。此外，Gd-PPF-SS-CA強(qiáng)化持續(xù)時(shí)間長，腫瘤組織中富含大量谷胱甘肽，Gd-PPF-SS-CA只能通過主鏈上的谷胱甘肽降解、斷裂來釋放含小分子Gd3+螯合物的低分子量片段，降解后產(chǎn)物的分子量和徑線均較大，排出腫瘤細(xì)胞緩慢，導(dǎo)致信號下降緩慢；而DTPA-Gd為小分子結(jié)構(gòu)，弛豫效能低，代謝速率較快，故成像效果和成像窗口時(shí)間均低于Gd-PPF-SS-CA。

3.3 材料毒性分析 電正性大分子進(jìn)入體內(nèi)易被荷負(fù)電的蛋白或紅細(xì)胞所吸附，進(jìn)而產(chǎn)生體內(nèi)應(yīng)激急性反應(yīng)，如炎癥或溶血等。本研究靜脈注射Gd-PPF-SS-CA 24 h后觀察，小鼠主要臟器均未見異常表現(xiàn)，表明Gd-PPF-SS-CA的生物相容性良好。

綜上所述， Gd-PPF-SS-CA作為MR對比劑具有優(yōu)異的弛豫效能，能夠提高腫瘤對比度，且可在保證成像效果的同時(shí)利用材料結(jié)構(gòu)本身的降解特性實(shí)現(xiàn)體內(nèi)迅速代謝，以明顯降低甚至避免Gd3+滯留所致毒副反應(yīng)。