黃龍止咳顆粒對咳嗽變異性哮喘大鼠氣道高反應、氣道炎癥及氣道重塑的干預效應*

劉菊華，辜建偉，胡 泉，劉 磊，涂 翔，何成詩△

(1.成都中醫藥大學附屬醫院， 成都 610000； 2.川北醫學院附屬醫院， 四川 南充 637000)

咳嗽變異型哮喘(cough variant asthma，CVA)是一種特殊類型的哮喘，臨床表現以反復發作性、刺激性咳嗽為主，占我國慢性咳嗽患者的75%[1]。其發病機制復雜，國內外研究證實TH1/TH2 細胞免疫失衡是其病因之一[2-3]，而氣道高反應及氣道重塑是其病理特征[4-5]。目前對CVA的治療首選吸入性糖皮質激素、支氣管舒張劑及白三烯受體拮抗劑，療程8周以上。但是CVA的控制水平并不理想，54%的CVA最終進展為典型的支氣管哮喘[6]。因此尋找新的安全有效的治療方式對CVA的治療有著深遠影響。

中醫在治療CVA方面有著悠久歷史，“風邪”被認為是CVA發生及演變的主要致病因素，因此CVA治療以疏風宣肺、緩急解痙、利咽止咳為主。黃龍止咳顆粒(曾用名：敏咳煎、玄龍止咳顆粒。處方組成：麻黃、地龍、蟬蛻、五味子、防風、鉤藤)是何成詩教授的經驗方。本方重在滋陰宣肺、祛風止咳。在長達10余年的臨床運用中,黃龍止咳顆粒對CVA療效顯著，臨床前期研究表明，黃龍止咳顆粒能改善CVA患者的臨床癥狀及小氣道功能[7-8]。在此本文將以CVA大鼠為研究對象，進一步研究黃龍止咳顆粒對CVA大鼠氣道高反應、氣道慢性炎癥、氣道重塑的干預效應，及其對TH1/TH2細胞免疫失衡的調節作用。本研究已通過成都中醫藥大學附屬醫院實驗動物倫理委員會審查(審查編號2019DL-007)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠50只,6 周齡，體質量 140～160 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK(川)2015-030。

1.2 藥物

黃龍止咳顆粒處方組成：麻黃、五味子、防風、鉤藤、地龍、蟬蛻，購自成都中醫藥大學附屬醫院中藥房。地塞米松片(批號H44024469，規格0.75 mg×100片)，中國廣東華南藥業集團有限公司；卵清蛋白(ovalbumin ，OVA，批號A5503)，美國Sigma 公司；氫氧化鋁(批號S30353)，中國上海源葉生物科技有限公司；乙酰膽堿(Acetylcholine, Ach，批號RDD043)，美國Sigma公司；過碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff ，PAS，批號WB1008)，中國上海經科化學科技有限公司;Masson三色染色試劑盒(批號AG1345-8), 中國上海梵態生物科技有限公司。

1.3 主要試劑及儀器

白介素4(Interleukin-4，IL-4)試劑盒(批號M4000B), 美國R&D公司; γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)試劑盒(批號MIF00)，美國R&D公司；轉化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)試劑盒(批號MB100B)，美國R&D公司；BA200Digital型數碼三目攝像顯微攝像系統，德國麥克奧迪實業集團有限公司；FOT100型大鼠肺功能儀，美國eSpira公司。

1.4 動物分組

大鼠喂養于成都中醫藥大學SPF級動物實驗室，飼養環境：12～12 h晝夜交替，保持動物自由飲水、進食，保持室溫23～25 ℃。適應性喂養一周后，將大鼠隨機分為空白組、模型組，中藥組，西藥組，聯合組，每組各10只大鼠。本實驗已通過成都中醫藥大學附屬醫院實驗動物倫理委員會審查(審查編號：2019DL-007)。

1.5 動物模型的建立及干預

圖1示，適應性喂養1周后，將大鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、中藥組、西藥組、聯合組每組各10只。參考經典動物模型方法[9-10]做適當改良復制CVA模型：(1)基礎致敏階段：除空白組用生理鹽水 1 mL外，其余各組按照每只大鼠1%卵清蛋白(ovalbumin，OVA)+氫氧化鋁10 mg 1 mL，于 0、7天分別在兩后足跖、腹股溝、腰、背、頸部共取10處，每處皮下注射0.05 mL，同時腹腔注射0.5 ml；(2)局部激發階段：除空白組霧化吸入生理鹽水外，其余各組從第15天開始霧化吸入1%OVA懸混液30 min/次，每日1次，連續激發21 d。激發后出現以下表現可初步認為模型成功，如煩躁不安、打噴嚏、喘息、呼吸加快等癥狀；(3)藥物干預：從第21天開始每次激發前30 min灌胃。中藥組參考本實驗前期研究[11]，根據《中藥新藥臨床研究指導原則》，按照臨床用藥量的6倍給予黃龍止咳顆粒1.15 g/ml灌胃；西藥組參考文獻[10]地塞米松片 2.5 mg/kg；聯合組給予黃龍止咳顆粒+地塞米松，劑量同前；模型組及空白組等量生理鹽水灌胃，連續14 d。

圖1 OVA誘導CVA大鼠模型及黃龍止咳顆粒干預CVA大鼠流程示意圖

1.6 取材

實驗第36天，6%水合氯醛0.6 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠后氣管切開插管。按照以下順序采集數據及標本：測量氣道高反應測驗；腹主動脈采血3～5 ml，3000 r/min離心 10 min 后取上清液；收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)；取肺組織10%多聚甲醛固定。

1.7 測量指標

1.7.1 氣道阻力測定 將氣管留置導管連接大鼠肺功能儀，通氣平衡后測氣道阻力(airway resistance, AR)作為基礎值。依次按濃度梯度吸入10 μl乙酰膽堿(Acetylcholine, Ach)(0，3.125 mg/mL,6.25 mg/mL,12.5 mg/mL,25 mg/mL)，記錄AR值，以 Ach 濃度為橫坐標，AR為縱坐標，繪制反應曲線則表示氣道阻力值。

1.7.2 BALF中炎癥細胞計數及分類 結扎右主支氣管，生理鹽水5 ml經氣管導管灌洗左肺3次，回收BALF，離心后取上清液保存。沉淀細胞經1 ml PBS 混勻后取 20 μL 使用細胞計數儀對細胞總數進行計數。取細胞懸液，經瑞氏-吉姆薩染色后顯微鏡下進行細胞分類計數(分為2類：中性粒細胞、嗜酸性粒細胞)。每張切片于40倍下觀察大體病變，在400視野下隨機選取若干個不同視野，計數200個細胞中中性及嗜酸性細胞所占百分率。

1.7.3 肺組織形態學檢查 新鮮肺組織10%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后行常規蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin， HE)染色，觀察氣道形態學改變、過碘酸雪夫(periodic acid-schiff，PAS)染色觀察氣道杯狀細胞計數，Masson三色染色法觀察肺組織纖維含量。采用BA200Digital數碼三目攝像顯微攝像系統對切片進行圖像采集，每張切片先于40倍下觀察全部組織大體病變，選擇要觀察的區域采集200或400倍圖片保存觀察具體病變。每張切片選取3個視野觀察，杯狀細胞計數每個視野計數后取均值作為該切片的平均細胞數；纖維含量采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定所采集圖像的光密度和面積，計算平均光密度，再使用3張圖像的平均光密度，計算平均數作為該樣本組織中的纖維含量。

1.7.4 血清及BALF中IL-4, IFN-γ,TGF-β含量 采用雙抗夾心酶聯免疫吸附實驗(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)，檢測大鼠血清及BALF中 IL-4、IFN-γ、TGF-β含量，操作步驟參考試劑盒說明書,按照復溫、加樣、配液、洗滌、顯色、終止、測定的順序進行。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況觀察

CVA模型組霧化吸入OVA激發后出現呼吸加快、咳嗽、打噴嚏、流涕、抓耳撓腮、躁動不安等表現。未激發時模型組活動較空白組減少，進食減少，毛色不如正常大鼠光滑。中藥組、西藥組及聯合組也有不同程度上述表現，但癥狀較模型組輕微。

2.2 各組大鼠吸入不同濃度Ach后的氣道阻力值及阻力曲線圖

表1圖2示，通過測量大鼠吸入不同濃度Ach后的氣道阻力值來反映氣道高反應。CVA大鼠氣道阻力在基線水平時稍高于正常大鼠，但差異無統計學意義(P>0.05)。吸入不同濃度Ach后,各組大鼠的氣道阻力均逐漸增加，CVA大鼠的氣道阻力顯著高于空白組(P<05)。在Ach濃度為3.125至12.5 mg/mL時,各治療組氣道阻力均低于模型組(P<0.05)，聯合組的氣道阻力在各治療組中最低(P<0.01)，中藥組及西藥組的氣道阻力比較差異無統計學意義(P>0.05)。在Ach濃度增加為25 mg/ml時,聯合組、西藥組、中藥組及模型組氣道阻力依次遞增，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠吸入不同濃度Ach的氣道阻力值

圖2 各組大鼠吸入乙酰膽堿后的氣道阻力曲線圖

2.3 各組大鼠BALF中炎癥細胞計數及分類結果

表2圖3示。模型組BALF中炎癥細胞總數、中性粒細胞百分率及嗜酸性細胞百分率均較空白組明顯升高(P<0.01)。經藥物治療后，聯合組、西藥組及中藥組BALF中炎癥細胞均較模型組有不同程度減少(P<0.05或P<0.01)，但仍高于空白組(P<0.05)。其中聯合治療組炎癥細胞計數在各治療組中最低(P<0.01)，中藥組稍高于西藥組，但組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠BALF中炎癥細胞計數及分類

圖3 瑞氏-吉姆薩染色顯示各組大鼠BALF中嗜酸性粒細胞及中性粒細胞(標尺：10 μm;紅色箭頭：中性粒細胞； 藍色箭頭：嗜酸性粒細胞)

2.4 各組大鼠肺組織形態學改變

2.4.1 常規HE染色 圖4示，空白組肺組織各級支氣管分支結構正常，僅有少量炎性細胞浸潤，氣道壁薄，厚度均勻。模型組部分氣道管壁增厚，管腔狹窄，管腔內黏液分泌增加，支氣管周圍、肺間質及肺泡腔可見大量炎性細胞浸潤(箭頭所指)，局部區域肺泡被炎性細胞填充；各藥物治療組炎癥細胞浸潤較模型組均有不同程度減輕，其中聯合用藥組炎癥細胞浸潤改善最明顯。

圖4 HE染色顯示各組大鼠肺組織形態學改變 (HE ×200)(箭頭為炎癥細胞)

2.4.2 PAS染色 圖5示，大鼠氣道黏膜中杯狀細胞染色后呈紫紅色。與空白組比較，模型組杯狀細胞的數量明顯增多(21.65±4.16 vs 63.76±7.92,P<0.01)。各治療組均可不同程度地減少杯狀細胞增生情況，杯狀細胞計數從高至低依次為中藥組(55.28±12.16)、西藥組(51.82±6.60)，聯合組杯狀細胞計數在治療組中最低(P<0.01),但仍高于空白組(31.68±6.09 vs 21.65±4.16,P=0.01)。

圖5 PAS染色顯示各組大鼠肺組織杯狀細胞 (×400)(箭頭所指為杯狀細胞)

2.4.3 Masson三色染色法 圖6示，大鼠氣管上皮下膠原纖維染色后呈藍色，肌纖維呈紅色。與空白組比較，模型組存在明顯的上皮下膠原纖維沉積，肌成纖維增生，其纖維組織光密度值高于空白組(39.44±4.76 vs 31.27±3.34,P<0.01)。各治療組均可不同程度延緩上皮下膠原沉積，其纖維組織光密度值由高至低為中藥組(39.11±3.66)、西藥組(38.73±3.53)、聯合組(35.73±3.29)。在觀察時間內，僅聯合組纖維組織光密度值較模型組顯著降低(P=0.03)，但仍高于空白組(P=0.01)。

圖6 Masson三色染色法顯示各組大鼠纖維組織 (×400)(箭頭所指為纖維組織)

2.5 各組大鼠BALF及血清中IL-4、IFN-γ及IGF-β含量比較

表3示，與空白組比較，模型組血清及BALF中IL-4和IGF-β含量明顯增加(P<0.05),IFN-γ含量降低(P<0.01)。各治療組均可不同程度地降低CVA大鼠血清及BALF中IL-4和IGF-β含量(P<0.05)，增加IFN-γ含量(P<0.05)。各治療組中，聯合組血清及BALF中IL-4、TGF-β含量最低(P<0.05)，IFN-γ含量最高(P<0.05),西藥組及中藥組次之。

表3 各組大鼠血清及支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ及IGF-β含量比較

3 討論

CVA作為一種特殊類型的哮喘，其主要的病理生理改變與典型哮喘一致，主要表現為氣道高反應，氣道慢性炎癥反應及不同程度的氣道重塑。CVA的發病機制目前尚不清楚，可能與遺傳、免疫及神經反射等多方面因素相關。近年來研究發現，TH1/TH2 免疫失衡參與了該病的發生發展。THl細胞主要釋放 IFN-γ、白介素-2(Interleukin-2， IL-2)、白介素3(Interleukin-3，IL-3)等細胞因子，其中以IFN-γ為代表，對CVA有保護作用；TH2細胞主要分泌IL-4、白介素-5(Interleukin-5，IL-5)、白介素-13(Interleukin-13，IL-13)等細胞因子,以IL-4為代表，可促進CVA發病和氣道炎癥形成[12-13]。在本實驗中，CVA大鼠吸入Ach后氣道阻力較空白組明顯增加。同時BALF中炎癥細胞總數、中性粒細胞百分比及嗜酸性粒細胞百分比均較正常大鼠明顯增加，肺組織形態學檢查提示，CVA大鼠肺組織存在明顯炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生、上皮下膠原纖維沉積，因此本實驗所復制的CVA大鼠模型較為成功。

CVA的一線治療藥物吸入性糖皮質激素可通過降低CVA患者血清IL-4水平，調控TH1/TH2細胞免疫失衡，從而減輕氣道炎癥反應,緩解CVA臨床癥狀[14]。何成詩認為，CVA的慢性咳嗽具有反復性、痙攣性、發作性的特點，結合中醫理論“風者，善行而數變”“風為陽邪，易化燥傷陰”和國醫大師晁恩祥“風盛攣急”的理論，故CVA的發病與“風”關系密切，治療應從“風”論治，以祛風、恢復肺的宣降功能為主。此外還認為目前時疫流行改變、霧霾嚴重，肺司呼吸，肺陰易損，因此四季咳嗽多初起即有肺燥陰傷，且久咳傷津化燥、久病入絡，易變生他病。肺為嬌臟，喜潤而惡燥，喜清肅而不耐寒熱，故治咳應重在滋陰宣肺、祛風止咳，據此研制出“黃龍止咳顆粒”。在本實驗中，中藥組大鼠氣道高反應、氣道炎癥細胞計數均較模型組減輕，因此黃龍止咳顆粒對CVA大鼠療效確切。各治療組大鼠血清及BALF中IL-4水平均有不同程度降低，IFN-γ水平有不同程度增加，中藥組與西藥組療效無顯著差異，聯合治療組療效最為顯著。因此黃龍止咳顆粒可通過調節INF-γ及IL-4水平調控TH1/TH2細胞免疫失衡，減輕氣道炎癥反應，達到治療CVA的目的。對于其具體分子生物學機制可能與黃龍止咳顆粒處方中的麻黃、五味子及地龍具有免疫調節功能相關。麻黃濃縮液提取物麻黃-9905具有免疫抑制作用，一方面可以使免疫器官萎縮，減少T 淋巴細胞形成，另一方面可以調整T淋巴細胞亞群細胞比例[15]。五味子多糖具有免疫興奮作用，可促進T淋巴細胞轉化[16]；地龍提取物可有效抑制OVA誘發的哮喘小鼠肺中核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB，NF-κB)信號激活，并減輕氣道高反應和TH2型炎癥反應[17]。

氣道重塑是CVA進展為難治性哮喘的病理基礎，其發病主要與氣道慢性炎癥損傷及異常修復相關。近年來研究證實，TGF-β參與氣道重塑的發生及進展[18]。一些中藥可通過抑制TGF-β的表達延緩氣道重塑。如玉屏風散可通過降低TGF-β含量減少上皮間質轉化，從而延緩粉塵刺激引起到氣道重塑[19]，蘇黃止咳膠囊(處方組成：麻黃、紫蘇葉、地龍、枇杷葉、紫蘇子、蟬蛻、前胡、牛蒡子、五味子)，也可通過減少OVA誘導CVA小鼠血清及BALF中TGF-β含量，減少肺組織TGF-β表達而減輕CVA小鼠氣道杯狀細胞增生及上皮下膠原沉積，延緩氣道重塑[10]。黃龍止咳顆粒處方組成與蘇黃止咳膠囊相似。在本實驗中，黃龍止咳顆粒可減少CVA大鼠氣道杯狀細胞增生。但是本實驗組中，各治療組上皮下膠原沉積雖有不同程度降低，但僅聯合組較模型組有顯著降低，筆者推測與本實驗觀察時間較短相關。因此本實驗在后續研究中，將延長觀察時間繼續研究黃龍止咳顆粒對CVA氣道重塑的干預效應。此外，有關黃龍止咳顆粒調控TH1/TH2細胞免疫失衡的具體分子生物學機制及其所涉及的微觀改變是否存在劑量-效應關系，在本實驗的后續實驗中也將進一步進行論證。

總之，黃龍止咳顆粒可通過調控TH1/TH2細胞免疫失衡，降低 CVA氣道高反應，減輕氣道炎癥反應，延緩氣道重塑。黃龍止咳顆粒對CVA的療效與糖皮質激素相當，在CVA的治療中可作為糖皮質激素的替代用藥，若與糖皮質激素聯合用藥療效更優。